Alkaliskt fosfatas - Alkaline phosphatase

Alkaliskt fosfatas
1ALK.png
Banddiagram (regnbågsfärg, N-terminal = blå, C-terminal = röd) av den dimera strukturen hos bakteriellt alkaliskt fosfatas.
Identifierare
EG -nr. 3.1.3.1
CAS -nr. 9001-78-9
Databaser
IntEnz IntEnz -vy
BRENDA BRENDA -inträde
ExPASy NiceZyme -vy
KEGG KEGG -post
MetaCyc Metabolisk väg
PRIAM profil
PDB -strukturer RCSB PDB PDBe PDBsum
Genontologi AmiGO / QuickGO
Alkaliskt fosfatas
PDB 1alk EBI.jpg
Struktur av alkaliskt fosfatas.
Identifierare
Symbol Alk_fosfatas
Pfam PF00245
InterPro IPR001952
SMART SM00098
PROSIT PDOC00113
SCOP2 1alk / SCOPe / SUPFAM

Alkaliskt fosfatas ( ALP , ALKP , ALPas , Alk Phos ) ( EC 3.1.3.1 ), eller basisk fosfatas , är ett homodimert protein enzym av 86 kilodalton . Varje monomer innehåller fem cysteinrester , två zinkatomer och en magnesiumatom avgörande för dess katalytiska funktion, och den är optimalt aktiv vid alkaliska pH -miljöer.

ALP har den fysiologiska rollen som avfosforylerande föreningar. Enzymet finns över en mängd organismer, prokaryoter och eukaryoter lika, med samma allmänna funktion men i olika strukturella former som är lämpliga för den miljö de fungerar i. Alkaliskt fosfatas finns i det periplasmatiska utrymmet hos E. coli -bakterier. Detta enzym är värmestabilt och har sin maximala aktivitet vid högt pH. Hos människor finns det i många former beroende på dess ursprung i kroppen - det spelar en integrerad roll i ämnesomsättningen i levern och utvecklingen i skelettet. På grund av dess utbredda utbredning i dessa områden används dess koncentration i blodomloppet av diagnostiker som en biomarkör för att hjälpa till att fastställa diagnoser som hepatit eller osteomalaci .

Nivån av alkaliskt fosfatas i blodet kontrolleras genom ALP -testet, som ofta ingår i rutinmässiga blodprov. Nivåerna av detta enzym i blodet beror på faktorer som ålder, kön eller blodtyp. Blodnivåerna av alkaliskt fosfatas ökar också med två till fyra gånger under graviditeten. Detta är ett resultat av ytterligare alkaliskt fosfatas som produceras av moderkakan. Dessutom kan onormala nivåer av alkaliskt fosfatas i blodet indikera problem relaterade till levern, gallblåsan eller benen. Njurtumörer och infektioner samt undernäring har också visat onormal nivå av alkaliskt fosfatas i blodet. Alkaliska fosfatasnivåer i en cell kan mätas genom en process som kallas "Poängmetoden". Ett blodprov tas vanligtvis och färgas för att kategorisera varje leukocyt i specifika "leukocyt alkaliska fosfatasindex". Denna markör är utformad för att skilja leukocyter och bestämma olika enzymaktivitet från varje provs färgningsgrad.

Bakteriell

I gramnegativa bakterier , såsom Escherichia coli ( E. coli ), är alkaliskt fosfatas beläget i det periplasmatiska utrymmet , utanför det inre cellmembranet och inom peptidoglykandelen av cellväggen. Eftersom det periplasmatiska gapet är mer benäget för miljövariationer än den inre cellen, är alkaliskt fosfatas lämpligt resistent mot inaktivering, denaturering eller nedbrytning . Denna egenskap hos enzymet är ovanlig för många andra proteiner.

Den exakta strukturen och funktionen för de fyra isozymerna (Int i E.coli ) är enbart inriktade på att leverera en källa till oorganiskt fosfat när miljön saknar denna metabolit. De fyra enzymerna är beroende av placeringen av vävnadsuttrycket. De fyra platserna för vävnadsuttryck är Intestinal AlP, Placental ALP, Germ Cell ALP och Liver/Ben/Kidney ALP. De oorganiska fosfaterna som produceras av dessa isozymer binds sedan till bärarproteiner som levererar de oorganiska fosfaterna till ett specifikt transportsystem med hög affinitet, känt som Pst-systemet, som transporterar fosfat över det cytoplasmatiska membranet.

Medan det yttre membranet av E. coli innehåller poriner som är permeabla för fosforylerade föreningar, gör det inte det inre membranet. Sedan uppstår en fråga om hur man transporterar sådana föreningar över det inre membranet och in i cytosolen. Visst, med den starka anjoniska laddningen av fosfatgrupper tillsammans med resten av föreningen är de mycket oblandbara i det opolära området i tvåskiktet. Lösningen uppstår genom att klyva fosfatgruppen från föreningen via ALP. I själva verket ger detta enzym, tillsammans med den förening som fosfatet var bunden till, rent oorganiskt fosfat som slutligen kan riktas av det fosfatspecifika transportsystemet (Pst-systemet) för translokation till cytosolen. Som sådant är huvudsyftet med defosforylering med alkaliskt fosfatas att öka diffusionshastigheten för molekylerna in i cellerna och hindra dem från att spridas ut.

Alkaliskt fosfatas är ett zinkinnehållande dimert enzym med MW: 86 000 Da, varje subenhet innehåller 429 aminosyror med fyra cysteinrester som länkar de två subenheterna. Alkaliskt fosfatas innehåller fyra Zn -joner och två Mg -joner, där Zn upptar aktiva platser A och B, och Mg upptar plats C, så det fullt aktiva nativa alkaliska fosfataset kallas (Zn A Zn B Mg C ) 2 -enzym. Verkningsmekanismen för alkaliskt fosfatas involverar den geometriska koordineringen av substratet mellan Zn -jonerna på de aktiva platserna, medan Mg -stället inte verkar vara tillräckligt nära för att direkt kunna delta i hydrolysmekanismen, men det kan bidra till formen av den elektrostatiska potentialen runt det aktiva centrumet. Alkaliskt fosfatas har en Km på 8,4 x 10 −4 .

Alkaliskt fosfatas i E. coli är ovanligt lösligt och aktivt vid förhöjda temperaturförhållanden såsom 80 ° C. På grund av den rörelseenergi som induceras av denna temperatur försämras de svaga vätebindningarna och hydrofoba interaktionerna av vanliga proteiner och förenas därför och fälls ut. Vid dimerisering av ALP blir emellertid bindningarna som bibehåller dess sekundära och tertiära strukturer effektivt begravda så att de inte påverkas lika mycket vid denna temperatur. Dessutom har ALP även vid mer förhöjda temperaturer som 90 ° C den ovanliga egenskapen för omvänd denaturering. På grund av detta, medan ALP slutligen denaturerar vid cirka 90 ° C har den den extra förmågan att noggrant reformera sina bindningar och återgå till sin ursprungliga struktur och funktion när den svalnat igen.

Alkaliskt fosfatas i E. coli ligger i det periplasmatiska utrymmet och kan därmed frigöras med hjälp av tekniker som försvagar cellväggen och frigör proteinet. På grund av enzymets lokalisering och enzymets proteinlayout är enzymet i lösning med en mindre mängd proteiner än det finns i en annan del av cellen. Proteinernas värmestabilitet kan också utnyttjas vid isolering av detta enzym (genom värmedaturering). Dessutom kan alkaliskt fosfatas analyseras med användning av p-nitrofenylfosfat. En reaktion där alkaliskt fosfatas defosforylerar det ospecifika substratet, p-nitrofenylfosfat för att producera p-nitrofenol (PNP) och oorganiskt fosfat. PNP: s gula färg och dess λ max vid 410 gör att spektrofotometri kan bestämma viktig information om enzymatisk aktivitet. Vissa komplexiteter av bakteriell reglering och metabolism föreslår att andra, mer subtila, ändamål för enzymet också kan spela en roll för cellen. I laboratoriet överlever emellertid mutant Escherichia coli som saknar alkaliskt fosfatas ganska bra, liksom mutanter som inte kan stänga av alkaliskt fosfatasproduktion.

Det optimala pH -värdet för E. coli -enzymets aktivitet är 8,0 medan bovint enzymets optimala pH är något högre vid 8,5. Alkaliskt fosfatas står för 6% av alla proteiner i nedtryckta celler.

Intragen komplement

När flera kopior av en polypeptid som kodas av en gen bildar ett aggregat kallas denna proteinstruktur som en multimer. När en multimer bildas av polypeptider producerade av två olika mutanta alleler av en viss gen, kan den blandade multimeren uppvisa större funktionell aktivitet än de icke -blandade multimererna som bildas av var och en av mutanterna ensam. I ett sådant fall kallas fenomenet intragenisk komplementation . E. coli alkaliskt fosfatas, ett dimerenzym, uppvisar intragenisk komplementation. När särskilda mutanta versioner av alkaliskt fosfatas kombinerades, uppvisade de heterodimera enzymerna som bildades som ett resultat en högre aktivitetsnivå än vad som skulle förväntas baserat på de relativa aktiviteterna hos föräldraenzymerna. Dessa fynd indikerade att dimerstrukturen för alkaliskt fosfatas av E. coli tillåter kooperativa interaktioner mellan de ingående monomererna som kan generera en mer funktionell form av holoenzymet.

Användning i forskning

Genom att ändra aminosyrorna i vildtyp alkaliskt fosfatasenzym som produceras av Escherichia coli skapas ett mutant alkaliskt fosfatas som inte bara har en 36-faldig ökning av enzymaktivitet, utan också bibehåller termisk stabilitet. Typiska användningsområden i laboratoriet för alkaliska fosfataser inkluderar avlägsnande av fosfatmonoestrar för att förhindra självligering, vilket är oönskat under plasmid-DNA-kloning .

Vanliga alkaliska fosfataser som används i forskning inkluderar:

  • Räka alkaliskt fosfatas (SAP), från en art av arktiska räkor ( Pandalus borealis ). Detta fosfatas inaktiveras enkelt av värme, en användbar funktion i vissa applikationer.
  • Kalv-tarm-alkaliskt fosfatas (CIP)
  • Placentalt alkaliskt fosfatas (PLAP) och dess C -terminalt stympade version som saknar de senaste 24 aminosyrorna (utgör domänen som riktar sig mot GPI -membranförankring) - det utsöndrade alkaliska fosfataset (SEAP). Det presenterar vissa egenskaper som värmestabilitet, substratspecificitet och motståndskraft mot kemisk inaktivering.
  • Mänskligt-tarmt alkaliskt fosfatas. Människokroppen har flera typer av alkaliskt fosfatas närvarande, vilka bestäms av minst tre genlokaliteter. Var och en av dessa tre loci styr en annan typ av alkaliskt fosfatas -isozym . Emellertid kan utvecklingen av detta enzym regleras strikt av andra faktorer såsom termostabilitet, elektrofores, inhibering eller immunologi.

Mänsklig-intestinal ALPas visar cirka 80% homologi med nötkreatur-tarm ALPas, vilket håller deras gemensamma evolutionära ursprung. Samma bovinazym har mer än 70% homologi med humant placentaenzym. Det mänskliga tarmenzymet och placentaenzymet delar dock bara 20% homologi trots deras strukturella likheter.

Alkaliskt fosfatas har blivit ett användbart verktyg i molekylärbiologiska laboratorier, eftersom DNA normalt har fosfatgrupper i 5' -änden. Avlägsnande av dessa fosfater förhindrar DNA från att ligera (5' -änden fäster vid 3' -änden), och håller därigenom DNA -molekyler linjära tills nästa steg i processen som de förbereds för; avlägsnande av fosfatgrupperna tillåter också radiomärkning (ersättning med radioaktiva fosfatgrupper) för att mäta närvaron av det märkta DNA genom ytterligare steg i processen eller experimentet. För dessa ändamål är det alkaliska fosfataset från räkor det mest användbara, eftersom det är lättast att inaktivera när det har gjort sitt jobb.

En annan viktig användning av alkaliskt fosfatas är som en etikett för enzymimmunoanalyser .

O differentierade pluripotenta stamceller har förhöjda nivåer av alkaliskt fosfatas på cellmembranet , därför används alkalisk fosfatasfärgning för att detektera dessa celler och för att testa pluripotens (dvs. embryonala stamceller eller embryonala carcinomceller ).

Det finns en positiv korrelation mellan serumalkaliskt fosfatas (B-ALP) i serum och benbildning hos människor, även om dess användning som biomarkör i klinisk praxis inte rekommenderas.

Pågående forskning

Nuvarande forskare undersöker ökningen av tumörnekrosfaktor-α och dess direkta effekt på uttrycket av alkaliskt fosfatas i vaskulära glattmuskelceller samt hur alkaliskt fosfatas (AP) påverkar de inflammatoriska svaren och kan spela en direkt roll för att förhindra organ skada.

  • Alkaliskt fosfatas (AP) påverkar de inflammatoriska reaktionerna hos patienter med kronisk njursjukdom och är direkt associerad med erytropoiesstimulerande medelresistent anemi.
  • Intestinal alkaliskt fosfatas (IAP) och mekanismen som det använder för att reglera pH och ATP -hydrolys i tolvfingertarmen från råtta.
  • Testa effektiviteten av inhibitorn och dess inverkan på IAP vid akut tarminflammation samt utforska IAP: s molekylära mekanismer för "förbättrad tarmpermeabilitet."

Mejeriindustrin

Huvudartikel: Pasteurisering § Verifiering

Alkaliskt fosfatas används ofta i mejeriindustrin som en indikator på framgångsrik pastörisering. Detta beror på att den mest värmestabila bakterien som finns i mjölk , Mycobacterium paratuberculosis , förstörs av temperaturer som är lägre än de som krävs för att denaturera ALP. Därför är ALP -närvaro idealisk för att indikera misslyckad pastörisering.

Pasteuriseringsverifiering utförs vanligtvis genom att mäta fluorescensen hos en lösning som blir fluorescerande när den utsätts för aktiv ALP. Fluorimetrianalyser krävs av mjölkproducenter i Storbritannien för att bevisa att alkaliskt fosfatas har denaturerats, eftersom p-nitrofenylfosfattester inte anses noggranna nog för att uppfylla hälsostandarder.

Alternativt kan färgförändringen av ett para-Nitrofenylfosfatsubstrat i en buffrad lösning (Aschaffenburg Mullen Test) användas. Råmjölk ger normalt en gul färg inom ett par minuter, medan korrekt pastöriserad mjölk inte bör visa någon förändring. Det finns undantag från detta, som i fallet med värmestabila alkaliska fosfataser som produceras av vissa bakterier, men dessa bakterier bör inte finnas i mjölk.

Hämmare

Alla däggdjurs alkaliska fosfatasisoenzymer utom placenta (PALP och SEAP) inhiberas av homoarginin , och på liknande sätt blockeras alla utom tarm- och placentasystem av levamisol . Fosfat är en annan hämmare som konkurrenskraftigt hämmar alkaliskt fosfatas.

Ett annat känt exempel på en alkalisk fosfatashämmare är [(4-nitrofenyl) metyl] fosfonsyra.

I metallförorenad jord hämmas alkaliskt fosfatas av Cd (kadmium). Dessutom förbättrar temperaturen hämningen av Cd på ALP -aktivitet, vilket visas i de ökande värdena på Km.

Mänsklig

Fysiologi

Hos människor finns alkaliskt fosfatas i alla vävnader i hela kroppen, men är särskilt koncentrerat i levern , gallgången , njuren , benet , tarmslemhinnan och moderkakan . I serum dominerar två typer av alkaliska fosfatas -isozymer : skelett och lever. Under barndomen är majoriteten av alkaliskt fosfatas av skelettursprung. Människor och de flesta andra däggdjur innehåller följande alkaliska fosfatas -isozymer:

  • ALPI - tarm (molekylvikt 150 kDa)
  • ALPL- vävnadsspecifik (uttryckt huvudsakligen i lever, ben och njure)
  • ALPP - placenta (Regan isozyme)
  • ALPG - könscell

Fyra gener kodar för de fyra isozymerna. Genen för vävnadsspecifikt alkaliskt fosfatas finns på kromosom 1 , och generna för de tre andra isoformerna finns på kromosom 2 .

Intestinal alkaliskt fosfatas

Intestinal alkaliskt fosfatas (IAP) utsöndras av enterocyter , och verkar spela en avgörande roll för tarmhomeostas och skydd samt för att undertrycka inflammation genom undertryckande av nedströms avgiftsliknande receptor (TLR) -4 -beroende och MyD88 -beroende inflammatorisk kaskad. Det defosforylerar giftiga/inflammatoriska mikrobiella ligander som lipopolysackarider (LPS), ometylerade cytosin-guanindinukleotider, flagellin och extracellulära nukleotider såsom uridindifosfat eller ATP. Deposforylering av LPS med IAP kan minska svårighetsgraden av Salmonella tryphimurium och Clostridioides difficile -infektion som återställer normal tarmmikrobiota. Således har förändrat IAP -uttryck varit inblandat i kroniska inflammatoriska sjukdomar såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD). Det verkar också reglera lipidabsorption och bikarbonatsekretion i duodenalslemhinnan, som reglerar ytans pH.

I cancerceller

Studier visar att det alkaliska fosfatasproteinet som finns i cancerceller liknar det som finns i icke -maligna kroppsvävnader och att proteinet härrör från samma gen i båda. En studie jämförde enzymerna i levermetastaser av gigantcelliga lungcancer och icke-maligna placentaceller. De två var liknande i NH två terminala sekvensen, peptidkarta, underenhet molekylvikt och isoelektronisk punkt.

I en annan studie där forskare undersökte närvaro av alkaliskt fosfatasprotein i en celllinje hos mänskliga tjocktarmscancer, även känd som HT-29, visade resultaten att enzymaktiviteten var liknande den för den icke-maligna tarmtypen. Denna studie avslöjade dock att utan påverkan av natriumbutyrat är alkaliskt fosfatasaktivitet ganska låg i cancerceller. En studie baserad på natriumbutyrateffekter på cancerceller förmedlar att den har effekt på androgenreceptor-samregulatoruttryck, transkriptionsaktivitet och även på histonacetylering i cancerceller. Detta förklarar varför tillsatsen av natriumbutyrat visar ökad aktivitet av alkaliskt fosfatas i cancercellerna i den mänskliga tjocktarmen. Dessutom stöder detta ytterligare teorin om att alkalisk fosfatasenzymaktivitet faktiskt finns i cancerceller.

I en annan studie odlades choriokarcinomceller i närvaro av 5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdUrd) och resultaten förmedlade en 30- till 40-faldig ökning av alkaliskt fosfatasaktivitet. Detta förfarande för att öka enzymets aktivitet är känt som enzyminduktion . Bevisen visar att det faktiskt finns aktivitet av alkaliskt fosfatas i tumörceller, men det är minimalt och måste förbättras. Resultat från denna studie indikerar vidare att detta enzyms aktiviteter varierar mellan de olika choriokarcinomcellinjerna och att aktiviteten hos det alkaliska fosfatasproteinet i dessa celler är lägre än i de icke-maligna placentacellerna. men nivåerna är betydligt högre hos barn och gravida kvinnor. Blodprov ska alltid tolkas med referensintervallet från laboratoriet som utförde testet. Höga ALP -nivåer kan uppstå om gallgångarna blockeras.

ALP ökar också om det förekommer aktiv benbildning, eftersom ALP är en biprodukt av osteoblastaktivitet (såsom fallet vid Pagets skelettsjukdom ).

ALP är mycket mer förhöjt i metastatiska prostatacancerceller än icke-metastatiska prostatacancerceller. Höga nivåer av ALP hos patienter med prostatacancer är förknippade med en signifikant minskning av överlevnaden.

Nivåerna är också förhöjda hos personer med obehandlad celiaki . Sänkta nivåer av ALP är mindre vanliga än förhöjda nivåer. Källan till förhöjda ALP -nivåer kan härledas genom att erhålla serumnivåer av gammaglutamyltransferas (GGT). Samtidig ökning av ALP med GGT bör öka misstanken om hepatobiliär sjukdom.

Vissa sjukdomar påverkar inte halterna av alkaliskt fosfatas, till exempel hepatit C. En hög nivå av detta enzym återspeglar inte någon skada i levern, även om höga alkaliska fosfatasnivåer kan bero på blockering av flödet i gallvägarna eller en ökning av levertrycket.

Förhöjda nivåer

Huvudartikel: Förhöjt alkaliskt fosfatas

Om det är oklart varför alkaliskt fosfatas är förhöjt, kan isoenzymstudier med elektrofores bekräfta källan till ALP. Skelfosfatas (som är lokaliserat i osteoblaster och extracellulära skikt av nysyntetiserad matris) släpps ut i cirkulation genom en ännu oklar mekanism. Placentalt alkaliskt fosfatas är förhöjt i seminom och aktiva former av rakitis , liksom i följande sjukdomar och tillstånd:

Sänkta nivåer

Följande tillstånd eller sjukdomar kan leda till minskade halter av alkaliskt fosfatas:

Dessutom har orala preventivmedel visat sig minska alkaliskt fosfatas.

Prognostiska användningsområden

Mätning av alkaliskt fosfatas (tillsammans med prostataspecifikt antigen) under och efter sex månader med hormonbehandlad metastatisk prostatacancer visade sig förutsäga patienternas överlevnad.

Leukocyt alkaliskt fosfatas

Leukocyt alkaliskt fosfatas (LAP) finns i mogna vita blodkroppar . Vita blodkroppar i LAP kan hjälpa till att diagnostisera vissa tillstånd.

Struktur och egenskaper

Alkaliskt fosfatas är homodimert enzym, vilket betyder att det bildas med två molekyler. Tre metalljoner, två Zn och en Mg, finns i de katalytiska platserna, och båda typerna är avgörande för att enzymatisk aktivitet ska inträffa. Enzymerna katalyserar hydrolysen av monoestrar i fosforsyra som dessutom kan katalysera en transfosforyleringsreaktion med stora koncentrationer av fosfatacceptorer. Medan huvuddragen i den katalytiska mekanismen och aktivitet är konserverade mellan däggdjurs- och bakteriellt alkaliskt fosfat, har däggdjurs alkaliskt fosfatas en högre specifik aktivitet och  K m  värden således en lägre affinitet, mer alkaliskt pH-optimum, lägre värmestabilitet, och är typiskt membranbundna och hämmas av l-aminosyror och peptider via ett sätt som inte är konkurrenskraftigt. Dessa egenskaper skiljer sig märkbart mellan olika däggdjursalkaliska fosfatas -isozymer och visar därför en skillnad i in vivo  -funktioner.

Alkaliskt fosfatas har homologi i ett stort antal andra enzymer och utgör en del av en överfamilj av enzymer med flera överlappande katalytiska aspekter och substrategenskaper. Detta förklarar varför de mest framträdande strukturella särdragen hos däggdjursalkaliner är som de är och hänvisar till deras substratspecificitet och homologi till andra medlemmar av nukleosidpyrofosfatas/fosfodiesterasfamiljen av isozym. Forskning har visat ett samband mellan medlemmar av den alkaliska fosfatasfamiljen med arylsulfataser. Likheterna i strukturen indikerar att dessa två enzymfamiljer kom från en gemensam förfader. Ytterligare analys har kopplat alkaliska fosfater och arylsulfataser till en större superfamilj. Några av de vanliga generna som finns i denna superfamilj är de som kodar för fosfodiesteraser såväl som autotoxin.

Se även

Referenser

Vidare läsning

externa länkar