Superupplöst mikroskopi - Super-resolution microscopy

Superupplösningsmikroskopi är en serie tekniker inom optisk mikroskopi som tillåter sådana bilder att ha upplösningar högre än de som åläggs av diffraktionsgränsen , vilket beror på ljusets diffraktion . Superupplösta bildtekniker förlitar sig på närfältet (foton-tunnelmikroskopi såväl som de som använder Pendry Superlens och optisk mikroskopi för närfältskanning ) eller på fjärrfältet . Bland tekniker som förlitar sig på det senare är de som förbättrar upplösningen endast blygsamt (upp till ungefär en faktor två) bortom diffraktionsgränsen, såsom konfokalmikroskopi med stängt hål eller med hjälp av beräkningsmetoder som dekonvolvering eller detektorbaserad pixel omfördelning (t.ex. omskanningsmikroskopi , pixeltilldelning ), 4Pi-mikroskopet och strukturerad belysningsmikroskopiteknik som SIM och SMI .

Det finns två stora grupper av metoder för superupplösande mikroskopi i fjärrfältet som kan förbättra upplösningen med en mycket större faktor:

  1. Deterministisk superupplösning: de vanligaste utsläpparna i biologisk mikroskopi, fluoroforer , visar ett olinjärt svar på excitation, som kan utnyttjas för att förbättra upplösningen. Sådana metoder inkluderar STED , GSD , RESOLFT och SSIM.
  2. Stokastisk superupplösning: den kemiska komplexiteten hos många molekylära ljuskällor ger dem ett komplext tidsmässigt beteende, som kan användas för att få flera närliggande fluoroforer att avge ljus vid separata tider och därmed bli lösbara i tid. Dessa metoder inkluderar Super-resolution optisk fluktuationsavbildning (SOFI) och alla enkelmolekylära lokaliseringsmetoder (SMLM), såsom SPDM , SPDMphymod , PALM , FPALM, STORM och dSTORM.

Den 8 oktober 2014 tilldelades Nobelpriset i kemi till Eric Betzig , WE Moerner och Stefan Hell för "utvecklingen av superupplöst fluorescensmikroskopi ", vilket ger " optisk mikroskopi in i nanodimensionen ". De olika metoderna för superupplösande mikroskopi antas alltmer av det biomedicinska forskarsamhället, och dessa tekniker blir oumbärliga verktyg för att förstå biologisk funktion på molekylär nivå.

Historia

År 1978 hade de första teoretiska idéerna utvecklats för att bryta Abbe-gränsen , som krävde användning av ett 4Pi-mikroskop som ett konfokalt laserskannande fluorescensmikroskop där ljuset fokuseras från alla sidor till ett gemensamt fokus som används för att skanna objektet genom punkt-för-punkt-excitation i kombination med punkt-för-punkt-detektion. Men publiceringen från 1978 hade dragit en felaktig fysisk slutsats (dvs en punktliknande ljuspunkt) och hade helt missat den axiella upplösningsökningen som den verkliga fördelen med att lägga till den andra sidan av den fasta vinkeln.

En del av följande information samlades in (med tillstånd) från en kemibloggs granskning av sub-diffraktionsmikroskopitekniker.

1986 patenterades ett superupplöst optiskt mikroskop baserat på stimulerad emission av Okhonin.

Superupplösningstekniker

Fotontunnelmikroskopi (PTM)

Lokal förbättring / ANSOM / optiska nano-antenner

Nära-fältet optisk slumpmässig kartläggning (NORM) mikroskopi

Nära-fältet optisk slumpmässig kartläggning (NORM) mikroskopi är en metod för optisk närfältinsamling med ett fjärrfältmikroskop genom observation av nanopartiklarnas bruna rörelse i en nedsänkningsvätska.

NORM använder objektyteskanning genom att stokastiskt flytta nanopartiklar. Genom mikroskopet ser nanopartiklar ut som symmetriska runda fläckar. Punktbredden motsvarar punktspridningsfunktionen (~ 250 nm) och definieras av mikroskopets upplösning. Lateralkoordinater för den givna partikeln kan utvärderas med en precision som är mycket högre än mikroskopets upplösning. Genom att samla in informationen från många ramar kan man kartlägga nära fältintensitetsfördelningen över mikroskopets hela synfält. I jämförelse med NSOM och ANSOM kräver denna metod ingen speciell utrustning för spetspositionering och har ett stort synfält och fokusdjup. På grund av det stora antalet skannande "sensorer" kan man uppnå bildförvärv på kortare tid.

4Pi

Ett 4Pi-mikroskop är ett laserskannande fluorescensmikroskop med en förbättrad axiell upplösning . Den typiskt värde på 500-700 nm kan förbättras till 100-150 nm, vilket motsvarar en nästan sfärisk fokal fläck med 5-7 gånger mindre volym än den hos standard konfokalmikroskopi .

Förbättringen i upplösning uppnås genom att använda två motstående objektiv, som båda är fokuserade på samma geometriska plats. Skillnaden i optisk väglängd genom var och en av de två objektiven minimeras också noggrant. Genom detta kan molekyler som bor i det gemensamma fokalområdet för båda målen belysas koherent från båda sidor, och det reflekterade eller avgivna ljuset kan samlas samman, dvs. koherent överlagring av utsänt ljus på detektorn är möjlig. Den fasta vinkel som används för belysning och detektion ökar och närmar sig det ideala fallet, där provet belyses och detekteras från alla sidor samtidigt.

Hittills har den bästa kvaliteten i ett 4Pi -mikroskop uppnåtts i samband med STED -mikroskopi i fasta celler och RESOLFT -mikroskopi med omkopplingsbara proteiner i levande celler.

Strukturerad belysningsmikroskopi (SIM)

Se även: Strukturerat ljus
Jämförelse av upplösningen som erhålls genom konfokal laserskanningsmikroskopi (överst) och 3D-strukturerad belysningsmikroskopi (3D-SIM-mikroskopi, nedtill). Detaljer om ett kärnvapenhölje visas . Kärnporer (anti-NPC) röda, kärnhölje (anti- lamin ) gröna, kromatin ( DAPI- färgande) blå. Skalstapel: 1 µm.

Strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) förbättrar rumsupplösningen genom att samla in information från frekvensutrymme utanför det observerbara området. Denna process utförs i ömsesidigt utrymme: Fouriertransformationen (FT) för en SI -bild innehåller överlagrad ytterligare information från olika områden i ömsesidigt utrymme; med flera ramar där belysningen förskjuts av någon fas , är det möjligt att beräkningsmässigt separera och rekonstruera FT -bilden, som har mycket mer upplösningsinformation. Omvänd FT returnerar den rekonstruerade bilden till en bild med superupplösning.

SIM -mikroskopi kan eventuellt ersätta elektronmikroskopi som ett verktyg för vissa medicinska diagnoser. Dessa inkluderar diagnos av njursjukdomar, njurcancer och blodsjukdomar.

Även om termen "strukturerad belysningsmikroskopi" myntades av andra under senare år, publicerade Guerra (1995) först resultat där ljus mönstrat av ett 50 nm tonhällsgaller upplyste ett andra galler med tonhöjd 50 nm, med gallren roterade med avseende på varje andra med den vinkelmängd som behövs för att uppnå förstoring. Även om den lysande våglängden var 650 nm, löstes 50 nm gallret lätt. Detta visade en nästan femfaldig förbättring jämfört med Abbe-upplösningsgränsen på 232 nm som borde ha varit den minsta som erhållits för den numeriska bländaren och våglängden som används. Vid vidareutveckling av detta arbete visade Guerra att superupplöst lateral topografi uppnås genom fasförskjutning av det flyktiga fältet. Flera amerikanska patent utfärdades till Guerra individuellt eller tillsammans med kollegor och tilldelades Polaroid Corporation . Licenser till denna teknik upphandlades av Dyer Energy Systems, Calimetrics Inc. och Nanoptek Corp. för användning av denna superupplösta teknik vid optisk datalagring och mikroskopi.

Rumsligt modulerad belysning (SMI)

SMI + TIRF av mänsklig ögonvävnad påverkad av makuladegeneration

En implementering av strukturerad belysning kallas spatialmodulerad belysning (SMI). Precis som standard strukturerad belysning modifierar SMI -tekniken punktspridningsfunktionen (PSF) för ett mikroskop på ett lämpligt sätt. I detta fall är dock "den optiska upplösningen i sig inte förbättrad"; istället används strukturerad belysning för att maximera precisionen i avståndsmätningar för fluorescerande objekt, för att "möjliggöra storleksmätningar vid molekylära dimensioner på några tiotals nanometer".

Den Vertico SMI mikroskop uppnår strukturerade belysning genom användning av en eller två motstående interfererande laserstrålarna längs axeln. Objektet som avbildas flyttas sedan i steg med hög precision genom vågfältet, eller så flyttas själva vågfältet i förhållande till objektet genom fasskift. Detta resulterar i en förbättrad axiell storlek och avståndsupplösning.

SMI kan kombineras med andra superupplösningsteknologier, till exempel med 3D LIMON eller LSI- TIRF som en total intern reflektionsinterferometer med lateralt strukturerad belysning (detta sista instrument och teknik är i huvudsak ett fasskiftat foton tunnelmikroskop, som använder en total intern reflektionsljusmikroskop med fasskiftat evanescent fält (Guerra, 1996)). Denna SMI-teknik gör att man kan förvärva ljusoptiska bilder av autofluorofore-fördelningar i sektioner från mänsklig ögonvävnad med tidigare oöverträffad optisk upplösning. Användning av tre olika excitationsvåglängder (488, 568 och 647 nm) gör att man kan samla spektral information om autofluorescenssignalen. Detta har använts för att undersöka mänsklig ögonvävnad som påverkas av makuladegeneration .

Deterministiska funktionstekniker

REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions (RESOLFT) mikroskopi är en optisk mikroskopi med mycket hög upplösning som kan avbilda detaljer i prover som inte kan avbildas med konventionell eller konfokal mikroskopi . Inom RESOLFT är principerna för STED -mikroskopi och GSD -mikroskopi generaliserade. Det finns också tekniker med andra begrepp än RESOLFT eller SSIM. Till exempel fluorescensmikroskopi med hjälp av den optiska OCH gate- egenskapen för kvävevakanscenter eller superupplösning genom Stimulated Emission of Thermal Radiation (SETR), som använder de inneboende superlinjäriteterna i Black-Body-strålningen och utökar begreppet super -upplösning bortom mikroskopi.

Stimulerad utsläppsminskning (STED)

Huvudartikel: STED -mikroskopi
Upplösningsförbättring mellan traditionell konfokalmikroskopi och STED -mikroskopi.

Stimulerad utsläppsminskningsmikroskopi (STED) använder två laserpulser, excitationspulsen för excitation av fluoroforerna till deras fluorescerande tillstånd och STED-pulsen för avexcitering av fluoroforer med hjälp av stimulerad emission . I praktiken appliceras excitationslaserpulsen först varefter en STED -puls snart följer (STED utan pulser med kontinuerliga våglasrar används också). Dessutom modifieras STED-pulsen på ett sådant sätt att den har en nollintensitetspunkt som sammanfaller med excitationsfokuspunkten. På grund av det icke-linjära beroendet av den stimulerade emissionshastigheten av STED-strålens intensitet kommer alla fluoroforer runt den fokala excitationspunkten att vara i avstängt tillstånd (fluoroforernas marktillstånd). Genom att skanna denna fokuspunkt hämtar man bilden. Den halvvärdesbredd (FWHM) av punktspridningsfunktionen (PSF) hos excitationen fokalpunkten kan teoretiskt komprimeras till en godtycklig bredd genom att höja intensiteten i STED puls, enligt ekvation ( 1 ).

   ( 1 )
där ∆r är den laterala upplösningen, ∆ är FWHM för diffraktionsbegränsad PSF, I max är toppintensiteten för STED -lasern och är tröskelintensiteten som behövs för att uppnå mättad utsläppsminskning.

Den största nackdelen med STED, som har förhindrat dess utbredda användning, är att maskinen är komplicerad. Å ena sidan är bildinsamlingshastigheten relativt långsam för stora synfält på grund av behovet av att skanna provet för att hämta en bild. Å andra sidan kan det vara mycket snabbt för mindre synfält: inspelningar på upp till 80 bilder per sekund har visats. På grund av att en stor jag s värde associerat med STED, finns det behov av en högintensiv excitationspuls, vilket kan orsaka skada på provet.

Marklägeutarmning (GSD)

Ground state-utarmningsmikroskopi (GSD-mikroskopi) använder triplettillståndet för en fluorofor som off-state och singlet-tillståndet som on-state, varigenom en excitationslaser används för att driva fluoroforerna i periferin av singlet-tillståndsmolekylen till triplett tillstånd. Detta är ungefär som STED, där off-state är fluoroforernas grundtillstånd, varför ekvation ( 1 ) också gäller i detta fall. Det värdet är mindre än i STED, vilket gör super-resolution imaging möjlig i mycket mindre laserintensitet. Jämfört med STED är fluoroforerna som används i GSD i allmänhet dock mindre fotostabila; och mättnaden i triplet -tillståndet kan vara svårare att inse.

Mättad strukturerad belysningsmikroskopi (SSIM)

Mättad strukturerad belysningsmikroskopi (SSIM) utnyttjar det olinjära beroendet av fluoroforernas emissionshastighet av excitationslaserens intensitet. Genom att applicera ett sinusformat belysningsmönster med en toppintensitet nära den som behövs för att mätta fluoroforerna i deras fluorescerande tillstånd, hämtar man Moiré -fransar. Utkanterna innehåller rumslig information av hög ordning som kan extraheras med beräkningsteknik. När informationen har extraherats hämtas en superupplöst bild.

SSIM kräver att belysningsmönstret skiftas flera gånger, vilket effektivt begränsar teknikens tidsupplösning. Dessutom finns det behov av mycket fotostabila fluoroforer, på grund av de mättande förhållandena, som orsakar strålskador på provet och begränsar de möjliga applikationer för vilka SSIM kan användas.

Exempel på denna mikroskopi visas under avsnittet Strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) : bilder av cellkärnor och mitotiska stadier inspelade med 3D-SIM-mikroskopi.

Stokastiska funktionstekniker

Lokaliseringsmikroskopi

Enmolekylär lokaliseringsmikroskopi (SMLM) sammanfattar alla mikroskopiska tekniker som uppnår superupplösning genom att isolera sändare och anpassa sina bilder med punktspridningsfunktionen (PSF). Normalt begränsar bredden på punktspridningsfunktionen (~ 250 nm) upplösningen. Med tanke på en isolerad sändare kan man dock bestämma sin plats med en precision som endast begränsas av dess intensitet enligt ekvation ( 2 ).

   ( 2 )
där Δloc är lokaliseringsprecisionen, Δ är FWHM (full bredd vid halv max) för PSF och N är antalet insamlade fotoner.

Denna anpassningsprocess kan endast utföras på ett tillförlitligt sätt för isolerade sändare (se Deconvolution ), och intressanta biologiska prover är så tätt märkta med sändare att montering är omöjlig när alla sändare är aktiva samtidigt. SMLM -tekniker löser detta dilemma genom att endast aktivera en gles delmängd av sändare samtidigt, lokalisera dessa få sändare mycket exakt, inaktivera dem och aktivera en annan delmängd.

Med tanke på bakgrund och kamerapixelering, och med hjälp av Gauss -approximation för punktspridningsfunktionen ( Airy disk ) för ett typiskt mikroskop, föreslås den teoretiska upplösningen av Thompson et al. och finjusterad av Mortensen et al .:

var
* σ är den gaussiska standardavvikelsen för samma platser i samma molekyl om den mäts flera gånger (t.ex. bildrutor för en video). (enhet m)
* σ PSF är den gaussiska standardavvikelsen för punktspridningsfunktionen, vars FWHM efter Ernst Abbe -ekvationen d = λ/(2 NA) . (enhet m)
* a är storleken på varje bildpixel. (enhet m)
* N sig är fotonräkningen av den totala PSF över alla pixlar av intresse. (enhetlös)
* N bg det genomsnittliga bakgrundsfotonräknandet per pixel (mörka räkningar som redan har tagits bort), vilket uppskattas vara kvadraten för den gaussiska standardavvikelsen för Poisson -fördelningsbakgrundsbruset för varje pixel över tid eller standardavvikelsen för alla pixlar med endast bakgrundsbrus , σ bg 2 . Ju större σ bg 2 , desto bättre approximation (t.ex. bra för σ bg 2 > 10, utmärkt för σ bg 2 > 1000). (enhetlös)
* Upplösning FWHM är ~ 2,355 gånger den gaussiska standardavvikelsen .

I allmänhet utförs lokaliseringsmikroskopi med fluoroforer. Lämpliga fluoroforer (t.ex. för STORM) bor i ett icke-fluorescerande mörkt tillstånd under större delen av tiden och aktiveras stokastiskt, typiskt med en excitationslaser med låg intensitet. En avläsningslaser stimulerar fluorescens och bleker eller fotoswitchar fluoroforerna tillbaka till ett mörkt tillstånd, vanligtvis inom 10–100 ms. I poängackumulering för avbildning i nanoskala -topografi (PAINT) är fluoroforerna fluorescerande före bindning och fluorescerande efter. Fotonerna som avges under fluorescerande fas samlas in med en kamera och den resulterande bilden av fluoroforen (som förvrängs av PSF) kan monteras med mycket hög precision, även i storleksordningen några få Ångström. Upprepa processen flera tusen gånger säkerställer att alla fluoroforer kan gå igenom det ljusa tillståndet och registreras. En dator rekonstruerar sedan en superupplöst bild.

De önskvärda egenskaperna hos fluoroforer som används för dessa metoder, för att maximera upplösningen, är att de ska vara ljusa. Det vill säga att de ska ha en hög extinktionskoefficient och ett högt kvantutbyte . De bör också ha ett högt kontrastförhållande (förhållande mellan antalet fotoner som avges i ljuset och antalet fotoner som avges i det mörka tillståndet). Dessutom är ett tätt märkt prov önskvärt, enligt Nyquist -kriterierna .

Mängden lokaliseringsmikroskopimetoder skiljer sig mest åt i den typ av fluoroforer som används.

Spektral precisionsavståndsmikroskopi (SPDM)

Enkel YFP -molekyl med superupplösningsmikroskopi / SPDMphymod

En enda, liten ljuskälla kan lokaliseras mycket bättre än upplösningen i ett mikroskop brukar tillåta: även om ljuset ger en suddig fläck, kan datoralgoritmer användas för att exakt beräkna mitten av den suddiga platsen, med hänsyn tagen till Mikroskopets punktspridningsfunktion , detektorns brusegenskaper etc. Detta tillvägagångssätt fungerar dock inte när det finns för många källor nära varandra: källorna suddas sedan samman.

Spektral precisionsavståndsmikroskopi (SPDM) är en familj av lokaliseringstekniker inom fluorescensmikroskopi som tar sig runt problemet med att det finns många källor genom att bara mäta några källor åt gången, så att varje källa är "optiskt isolerad" från de andra (dvs. , separerade med mer än mikroskopets upplösning, vanligtvis ~ 200-250 nm), om de undersökta partiklarna har olika spektralsignaturer, så att det är möjligt att titta på ljus från bara några molekyler åt gången med hjälp av lämpliga ljuskällor och filter. Detta uppnår en effektiv optisk upplösning flera gånger bättre än den konventionella optiska upplösningen som representeras av halvbredden av huvudmaximumet för den effektiva punktbildfunktionen.

Den strukturella upplösning som kan uppnås med hjälp av SPDM kan uttryckas i termer av det minsta mätbara avståndet mellan två punktformiga partiklar med olika spektrala egenskaper ("topologisk upplösning"). Modellering har visat att under lämpliga förhållanden avseende lokaliseringens precision, partikeltäthet etc. motsvarar den "topologiska upplösningen" en " rymdfrekvens " som, i termer av den klassiska definitionen, motsvarar en mycket förbättrad optisk upplösning. Molekyler kan också särskiljas på ännu mer subtila sätt baserat på fluorescerande livslängd och andra tekniker.

En viktig tillämpning är genomforskning (studie av genomets funktionella organisation ). Ett annat viktigt användningsområde är forskning om membranstrukturen.

SPDMphymod
Dubbel färglokaliseringsmikroskopi SPDMphymod/superupplöst mikroskopi med GFP- och RFP-fusionsproteiner

Lokaliseringsmikroskopi för många vanliga fluorescerande färgämnen som GFP , Alexa-färgämnen och fluoresceinmolekyler är möjlig om vissa fotofysiska förhållanden föreligger. Med denna så kallade fysiskt modifierbara fluoroforer (SPDMphymod) -teknologi är en enda laservåglängd med lämplig intensitet tillräcklig för nanoimaging i motsats till andra lokaliseringsmikroskopiteknologier som behöver två laservåglängder när speciella fotoomkopplingsbara/fotoaktiverbara fluorescensmolekyler används. Ett ytterligare exempel på användning av SPDMphymod är en analys av Tobaksmosaikviruspartiklar (TMV) eller studier av virus -cellinteraktion .

Baserat på övergångar från singlet-triplet state är det avgörande för SPDMphymod att denna process pågår och leder till att en enda molekyl först kommer in i ett mycket långlivat reversibelt mörkt tillstånd (med halveringstid på så många som flera sekunder) från som den återgår till ett fluorescerande tillstånd och avger många fotoner i flera millisekunder innan det återgår till ett mycket långlivat, så kallat irreversibelt mörkt tillstånd. SPDMphymod -mikroskopi använder fluorescerande molekyler som avger samma spektrala ljusfrekvens men med olika spektralsignaturer baserat på de blinkande egenskaperna. Genom att kombinera två tusen bilder av samma cell är det möjligt att med hjälp av optiska laserprecisionsmätningar spela in lokaliseringsbilder med avsevärt förbättrad optisk upplösning.

Standardfluorescerande färgämnen som redan framgångsrikt används med SPDMphymod -tekniken är GFP , RFP , YFP , Alexa 488 , Alexa 568, Alexa 647, Cy2 , Cy3, Atto 488 och fluorescein .

Kryogen optisk lokalisering i 3D (COLD)

Kryogen optisk lokalisering i tre dimensioner (COLD) gör det möjligt att bestämma de fyra biotinbindningsställena i proteinet streptavidin.

Kryogen optisk lokalisering i 3D (COLD) är en metod som gör det möjligt att lokalisera flera fluorescerande platser inom en enda liten till medelstor biomolekyl med upplösning i ångström. Lokaliseringsprecisionen i detta tillvägagångssätt förbättras eftersom den långsammare fotokemin vid låga temperaturer leder till ett högre antal fotoner som kan avges från varje fluorofor före fotoblekning. Som ett resultat uppnår kryogen stokastisk lokaliseringsmikroskopi den submolekylära upplösning som krävs för att lösa 3D-positionerna för flera fluoroforer fästa vid ett litet protein. Genom att använda algoritmer som är kända från elektronmikroskopi rekonstrueras 2D -projektionerna av fluoroforer till en 3D -konfiguration. COLD tar fluorescensmikroskopi till sin grundläggande gräns, beroende på etikettens storlek. Metoden kan också kombineras med andra strukturbiologiska tekniker-såsom röntgenkristallografi, magnetisk resonansspektroskopi och elektronmikroskopi-för att ge värdefull kompletterande information och specificitet.

Bindningsaktiverad lokaliseringsmikroskopi (BALM)

fBALM Lokaliseringsmikroskopi med en enda upplösning med en enda molekyl med hjälp av DNA-strukturfluktuationsassisterad bindningsaktiverad lokaliseringsmikroskopi

Bindningsaktiverad lokaliseringsmikroskopi (BALM) är ett generellt koncept för enkelmolekylär lokaliseringsmikroskopi (SMLM): superupplöst avbildning av DNA-bindande färgämnen baserat på att modifiera egenskaperna hos DNA och ett färgämne. Genom noggrann anpassning av den kemiska miljön-vilket leder till lokal, reversibel DNA-smältning och hybridiseringskontroll över fluorescenssignalen-kan DNA-bindande färgmolekyler införas. Interkalerande och mindre spårbindande DNA-färgämnen kan användas för att registrera och optiskt isolera endast några få DNA-bindande färgsignaler åt gången. DNA-strukturfluktuationsassisterad BALM (fBALM) har använts för att nanoskala skillnader i nukleär arkitektur, med en förväntad strukturell upplösning på cirka 50 nm. Imaging kromatin nanostruktur med bindningsaktiverad lokaliseringsmikroskopi baserat på DNA-strukturfluktuationer. Nyligen utnyttjades den signifikanta förbättringen av fluorescenskvantutbytet av NIAD-4 vid bindning till en amyloid för BALM-avbildning av amyloidfibriller och oligomerer.

STORM, PALM och FPALM

Huvudartikel: Fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi

Stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM) och fluorescensfotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (FPALM) är superupplösta bildtekniker som använder sekventiell aktivering och tidsupplöst lokalisering av fotoswitchbara fluoroforer för att skapa högupplösta bilder. Under avbildning aktiveras endast en optiskt upplösbar delmängd av fluoroforer till ett fluorescerande tillstånd vid varje givet ögonblick, så att positionen för varje fluorofor kan bestämmas med hög precision genom att hitta centroidpositionerna för enmolekylbilderna av en viss fluorofor. En delmängd av fluoroforer inaktiveras därefter och en annan delmängd aktiveras och avbildas. Iteration av denna process gör att många fluoroforer kan lokaliseras och en superupplöst bild konstrueras från bilddata.

Dessa tre metoder publicerades oberoende över en kort tidsperiod, och deras principer är identiska. STORM beskrevs ursprungligen med Cy5- och Cy3 -färgämnen fästa vid nukleinsyror eller proteiner, medan PALM och FPALM beskrevs med hjälp av fotoswitchbara fluorescerande proteiner. I princip kan alla fotoswitchbara fluoroforer användas, och STORM har demonstrerats med en mängd olika sonder och märkningsstrategier. Med hjälp av stokastisk fotoswitching av enstaka fluoroforer, såsom Cy5, kan STORM utföras med en enda röd laser -excitationskälla. Den röda lasern byter båda Cy5 -fluoroforen till ett mörkt tillstånd genom bildning av en addukt och återför därefter molekylen till det fluorescerande tillståndet. Många andra färgämnen har också använts med STORM.

Förutom enstaka fluoroforer kan färgämnen som består av en aktivatorfluorofor (som Alexa 405, Cy2 eller Cy3) och ett fotoswitchbart reporterfärgämne (som Cy5, Alexa 647, Cy5.5 eller Cy7) användas med STORM . I detta schema tjänar aktivatorfluoroforen, när den exciteras nära dess absorptionsmaximum, att återaktivera det fotoswitchbara färgämnet till fluorescerande tillstånd. Flerfärgad avbildning har utförts med hjälp av olika aktiveringsvåglängder för att skilja färgämnen-par, beroende på vilken aktivatorfluorofor som används, eller med spektralt distinkta fotoswitchbara fluoroforer, antingen med eller utan aktivatorfluoroforer. Fotostyrbara fluorescerande proteiner kan också användas. Mycket specifik märkning av biologiska strukturer med fotoswitchbara sonder har uppnåtts med antikroppsfärgning, direkt konjugering av proteiner och genetisk kodning.

STORM har också utökats till tredimensionell avbildning med hjälp av optisk astigmatism, där den elliptiska formen av punktspridningsfunktionen kodar för x-, y- och z-positionerna för prover upp till flera mikrometer tjocka, och har visats i levande celler. Hittills är den rumsliga upplösningen som uppnås med denna teknik ~ 20 nm i sidodimensionerna och ~ 50 nm i den axiella dimensionen; och tidsupplösningen är så snabb som 0,1–0,33 sekunder.

Poängackumulering för avbildning i nanoskala -topografi (PAINT)

Poängackumulering för avbildning i nanoskala topografi (PAINT) är en lokaliseringsmetod med en molekyl som uppnår stokastisk enmolekylerad fluorescens genom molekylär adsorption/absorption och fotoblekning/desorption. Det första färgämnet som användes var Nileröd som är icke -fluorescerande i vattenlösning men fluorescerande när det införs i en hydrofob miljö, såsom miceller eller levande cellväggar. Således hålls koncentrationen av färgämnet liten på nanomolär nivå, så att molekylens sorptionshastighet till det diffraktionsbegränsade området ligger i millisekundregionen. Den stokastiska bindningen av enkelfärgade molekyler (prober) till ett immobiliserat mål kan lösas rumsligt och tidsmässigt under ett typiskt bredfältsfluorescensmikroskop. Varje färgämne fotoblekas för att återföra fältet till ett mörkt tillstånd, så att nästa färgämne kan binda och observeras. Fördelen med denna metod, jämfört med andra stokastiska metoder, är att den förutom att erhålla den superupplösta bilden av det fasta målet kan mäta den dynamiska bindningskinetiken hos de diffunderande sondmolekylerna i lösning till målet.

Kombination av 3D-superupplösningsteknik (t.ex. utvecklingen av dubbel-helix-punktspridning i Moerners grupp), fotoaktiverade färgämnen, kraftberoende aktiv intermittency och poängackumulering för avbildning i nanoskala-topografi, SPRAIPAINT (SPRAI = Superupplösning av PoweR- beroende Active Intermittency) kan superlösa levande cellväggar. PAINT fungerar genom att upprätthålla en balans mellan färgabsorptionen/absorptionen och fotoblekning/desorptionshastigheten. Denna balans kan uppskattas med statistiska principer. Den adsorption eller absorption hastigheten av en utspädd löst ämne till en yta eller ett gränssnitt i en gas eller flytande lösning kan beräknas med Ficks lag . Fotobleknings-/desorptionshastigheten kan mätas för ett givet lösningstillstånd och belysningseffektdensitet.

DNA-FÄRG har utökats ytterligare för att använda vanliga färgämnen, där dynamisk bindning och avbindning av en färgmärkt DNA-sond till en fixerad DNA-origami används för att uppnå stokastisk enmolekylär avbildning. DNA-PAINT är inte längre begränsat till miljökänsliga färgämnen och kan mäta både adsorptionen och desorptionskinetiken hos sonderna till målet. Metoden använder kamerans suddiga effekt av rörliga färgämnen. När ett vanligt färgämne diffunderar i lösningen, suddas dess bild på en typisk CCD -kamera på grund av dess relativt snabba hastighet och den relativt långa kameraexponeringstiden, vilket bidrar till fluorescensbakgrunden. Men när det binder till ett fast mål slutar färgämnet att röra sig; och tydlig inmatning i punktspridningsfunktionen kan uppnås.

Termen för denna metod är mbPAINT ("mb" står för rörelseoskärpa ). När ett totalt internt reflektionsfluorescensmikroskop (TIRF) används för avbildning är excitationsdjupet begränsat till ~ 100 nm från substratet, vilket ytterligare minskar fluorescensbakgrunden från de suddiga färgämnena nära substratet och bakgrunden i bulklösningen. Mycket ljusa färgämnen kan användas för mbPAINT som ger typiska enstaka rumsliga upplösningar på ~ 20 nm och enmolekylära kinetiska tidsupplösningar på ~ 20 ms under relativt milda fotoexcitationsintensiteter, vilket är användbart för att studera molekylär separation av enstaka proteiner.

Den tidsmässiga upplösningen har förbättrats ytterligare (20 gånger) med hjälp av en rotationsfasmask placerad i Fourier -planet under datainsamling och lösning av den förvrängda punktspridningsfunktionen som innehåller tidsinformation. Metoden fick namnet Super Temporal-Resolved Microscopy (STReM).

Etikettfri lokaliseringsmikroskopi

Etikettfri lokaliseringsmikroskopi SPDM-Superupplösningsmikroskopi avslöjar tidigare odetekterbara intracellulära strukturer

Optisk upplösning av cellulära strukturer i intervallet cirka 50 nm kan uppnås, även i etikettfria celler, med hjälp av lokaliseringsmikroskopi SPDM .

Genom att använda två olika laservåglängder avslöjar SPDM cellulära objekt som inte kan detekteras under konventionella fluorescensbildningsförhållanden vid breda fält, förutom att göra en väsentlig upplösning förbättring av autofluorescerande strukturer.

Som kontroll överensstämmer positionerna för de detekterade objekten i lokaliseringsbilden med positionerna i ljusfältbilden.

Etikettfri superupplösningsmikroskopi har också visats med fluktuationerna hos en ytförstärkt Raman-spridningssignal på en mycket enhetlig plasmonisk metasyta.

Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)

dSTORM använder fotoomkopplingen av en enda fluorofor. I dSTORM är fluoroforer inbäddade i ett reducerande och oxiderande buffersystem (ROXS) och fluorescens är upphetsad. Ibland, stokastiskt, kommer fluoroforen in i en triplett eller något annat mörkt tillstånd som är känsligt för buffertens oxidationstillstånd, från vilket de kan få fluorescerande, så att enstaka molekylpositioner kan registreras. Utvecklingen av dSTORM -metoden skedde vid tre oberoende laboratorier vid ungefär samma tid och kallades också "reversibel fotoblekningsmikroskopi" (RPM), "markstatutarmningsmikroskopi följt av individuell molekylretur" (GSDIM), liksom den nu allmänt accepterade moniker dSTORM.

Programvara för lokaliseringsmikroskopi

Lokaliseringsmikroskopi beror starkt på programvara som exakt kan passa punktspridningsfunktionen (PSF) till miljontals bilder av aktiva fluoroforer inom några minuter. Eftersom de klassiska analysmetoderna och mjukvarusviterna som används inom naturvetenskapen är för långsamma för att beräkningslösa dessa problem, ofta tar timmar av beräkning för att bearbeta data mätt i minuter, har specialiserade program utvecklats. Många av dessa lokaliseringsprogrampaket har öppen källkod; de är listade på SMLM Software Benchmark. När molekylpositioner har bestämts måste platserna visas och flera algoritmer för visning har utvecklats.

Superupplöst optisk fluktuationsavbildning (SOFI)

Huvudartikel: Superupplösning av optisk fluktuation

Det är möjligt att kringgå behovet av PSF -anpassning som är inneboende i lokaliseringsmikroskopi med en molekyl (SMLM) genom att direkt beräkna pixlarnas temporala autokorrelation. Denna teknik kallas superupplösning optisk fluktuationsavbildning (SOFI) och har visat sig vara mer exakt än SMLM när densiteten hos samtidigt aktiva fluoroforer är mycket hög.

Allstädes närvarande lokaliseringsmikroskopi (OLM)

Omnipresent Localization Microscopy (OLM) är en förlängning av Single Molecule Microscopy (SMLM) -tekniker som möjliggör högdensitetsbildning av en enda molekyl med en osammanhängande ljuskälla (t.ex. en kvicksilverbågslampa) och en konventionell installation av epifluorescensmikroskop. En kort utbrott av djupblå excitation (med 350-380 nm, i stället för en 405 nm, laser) möjliggör en långvarig reaktivering av molekyler för en upplösning på 90 nm på testprover. Slutligen kan korrelativ STED- och SMLM -avbildning utföras på samma biologiska prov med hjälp av ett enkelt avbildningsmedium, vilket kan ge grund för en ytterligare förbättrad upplösning. Dessa fynd kan demokratisera superresolution imaging och hjälpa någon forskare att generera högdensitets enkelmolekylbilder även med en begränsad budget.

Kombination av tekniker

3D ljusmikroskopisk nanosizing (LIMON) mikroskopi

Superfärgad mikroskopi i 3D med Her2 och Her3 i bröstceller, standardfärger: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

Lätta MicrOscopical Nanosizing microscopy (3D LIMON) bilder, med Vertico SMI -mikroskop , möjliggörs genom kombinationen av SMI och SPDM , varvid först SMI, och sedan SPDM, processen tillämpas.

Den SMI process bestämmer centrum av partiklarna och att de sprids i riktningen av mikroskopaxeln. Medan mitten av partiklar/molekyler kan bestämmas med en precision på 1-2 nm, kan spridningen kring denna punkt bestämmas ner till en axiell diameter på cirka 30-40 nm.

Därefter sidled är positionen för individuell partikel / molekyl bestämdes med användning SPDM, uppnå en precision på några nanometer.

Som en biologisk applikation i 3D -färgläget uppnåddes de rumsliga arrangemangen för Her2/neu och Her3 -kluster . Positionerna i alla tre riktningarna för proteinklusterna kunde bestämmas med en noggrannhet på cirka 25 nm.

Integrerat korrelativt ljus och elektronmikroskopi

Att kombinera ett superupplöst mikroskop med ett elektronmikroskop möjliggör visualisering av kontextuell information, med märkning från fluorescensmarkörer. Detta övervinner problemet med den svarta bakgrunden som forskaren sitter kvar med när han bara använder ett ljusmikroskop. I ett integrerat system mäts provet med båda mikroskop samtidigt.

Förbättring av tekniker med hjälp av neurala nätverk

På grund av framsteg inom datorer med artificiell intelligens har nyligen djuplärande neurala nätverk använts för superupplösning av optiska mikroskopfotografiska bilder, från 40x till 100x, från 20x med ett optiskt mikroskop till 1500x, jämförbart med ett skanningselektronmikroskop , via en neural lins och med positronemissionstomografi och fluorescensmikroskopi.

Se även

Referenser

Vidare läsning