Fluorescensmikroskop - Fluorescence microscope

Ett upprättstående fluorescensmikroskop (Olympus BX61) med fluorescensfilterkubeltornet ovanför objektivlinserna, i kombination med en digitalkamera.
Fluorescens och konfokala mikroskop driftsprincip

Ett fluorescensmikroskop är ett optiskt mikroskop som använder fluorescens istället för, eller förutom, spridning , reflektion och dämpning eller absorption för att studera egenskaperna hos organiska eller oorganiska ämnen. "Fluorescensmikroskop" avser alla mikroskop som använder fluorescens för att generera en bild, oavsett om det är en enkel uppsättning som ett epifluorescensmikroskop eller en mer komplicerad design som ett konfokalt mikroskop , som använder optisk snittning för att få bättre upplösning av fluorescensbilden .

Princip

Provet belyses med ljus med en specifik våglängd (eller våglängder) som absorberas av fluoroforerna , vilket får dem att avge ljus med längre våglängder (dvs med en annan färg än det absorberade ljuset). Belysningsljuset separeras från den mycket svagare utsända fluorescensen genom användning av ett spektralemissionsfilter. Typiska komponenter i ett fluorescensmikroskop är en ljuskälla ( xenonbågslampa eller kvicksilverånga-lampa är vanliga; mer avancerade former är kraftfulla lysdioder och lasrar ), excitationsfiltret , dikroiska spegeln (eller dikroiska strålar ) och utsläpp filter (se bilden nedan). Filtren och den dikroiska stråldelaren väljs för att matcha de spektrala excitations- och emissionsegenskaperna för fluoroforen som används för att märka provet. På detta sätt avbildas fördelningen av en enda fluorofor (färg) åt gången. Flerfärgsbilder av flera typer av fluoroforer måste komponeras genom att kombinera flera enfärgsbilder.

De flesta fluorescensmikroskop som används är epifluorescensmikroskop, där excitation av fluoroforen och detektion av fluorescensen sker genom samma ljusväg (dvs genom målet). Dessa mikroskop används i stor utsträckning inom biologi och är grunden för mer avancerade mikroskopdesigner, såsom konfokalmikroskopet och det totala interna reflektionsfluorescensmikroskopet (TIRF).

Epifluorescensmikroskopi

Schemat över ett fluorescensmikroskop.

Majoriteten av fluorescensmikroskop, särskilt de som används inom biovetenskap , har epifluorescensdesign som visas i diagrammet. Ljuset från excitationsvåglängden belyser exemplaret genom objektivlinsen . Den fluorescens som emitteras av provet är fokuserad till detektorn av samma mål som används för exciteringen som för större upplösning kommer att behöva objektivlins med högre numerisk apertur . Eftersom det mesta av excitationsljuset överförs genom provet når endast reflekterat excitatoriskt ljus målet tillsammans med det utsända ljuset och epifluorescensmetoden ger därför ett högt signal-brus-förhållande. Den dikroiska stråldelaren fungerar som ett våglängdsspecifikt filter som överför fluorescerat ljus till okularet eller detektorn, men reflekterar eventuellt kvarvarande excitationsljus tillbaka mot källan.

Ljuskällor

Fluorescensmikroskopi kräver intensiv, nästan monokromatisk belysning som vissa utbredda ljuskällor, som halogenlampor inte kan ge. Fyra huvudtyper av ljuskälla används, inklusive xenonbågslampor eller kvicksilverånga-lampor med excitationsfilter , lasrar , superkontinuumkällor och högeffekts- LED . Lasrar används mest för mer komplexa fluorescensmikroskopitekniker som konfokalmikroskopi och total inre reflektionsfluorescensmikroskopi medan xenonlampor och kvicksilverlampor och lysdioder med ett dikroiskt excitationsfilter vanligen används för bredfält epifluorescensmikroskop. Genom att placera två mikrolinsmatriser i belysningsbanan för ett vidfält epifluorescensmikroskop kan mycket enhetlig belysning uppnås med en variationskoefficient på 1-2%.

Provberedning

3D-animering av diatomatom Corethron sp.
Visar överlagringar från fyra fluorescerande kanaler
(a) Grön: [DiOC6 (3) fluorescens] - fläckar cellulära membran som indikerar kärncellkropparna
(b) Cyan: [PLL -A546 fluorescens] - generisk motfärg för visualisering av eukaryota cellytor
(c) Blå: [Hoechst fluorescens] - fläckar DNA, identifierar kärnor
(d) Röd: [klorofyll autofluorescens] - löser kloroplaster 
Animationen börjar med att lägga över alla tillgängliga fluorescerande kanaler och klargör sedan visualiseringen genom att slå på och av kanaler
Ett prov av sillsperma färgades med SYBR grön i en kyvett belyses med blått ljus i ett epifluorescensmikroskop. SYBR -grönt i provet binder sig till sill -spermier -DNA: t och när det är bundet fluorescerar det och avger grönt ljus när det belyses av blått ljus.

För att ett prov ska vara lämpligt för fluorescensmikroskopi måste det vara fluorescerande. Det finns flera metoder för att skapa ett fluorescerande prov; Huvudteknikerna är märkning med fluorescerande fläckar eller, när det gäller biologiska prover, uttryck av ett fluorescerande protein . Alternativt kan den inneboende fluorescensen hos ett prov (dvs autofluorescens ) användas. Inom biovetenskaperna är fluorescensmikroskopi ett kraftfullt verktyg som möjliggör specifik och känslig färgning av ett prov för att upptäcka fördelningen av proteiner eller andra intressanta molekyler. Som ett resultat finns det en mängd olika tekniker för fluorescerande färgning av biologiska prover.

Biologiska fluorescerande fläckar

Många fluorescerande fläckar har utformats för en rad biologiska molekyler. Några av dessa är små molekyler som är inneboende fluorescerande och binder en biologisk molekyl av intresse. Större exempel på dessa är nukleinsyrafläckar som DAPI och Hoechst (upphetsad av UV -våglängdsljus) och DRAQ5 och DRAQ7 (optimalt exciterade av rött ljus) som alla binder det mindre spåret av DNA och därmed märker cellkärnorna . Andra är läkemedel, toxiner eller peptider som binder specifika cellulära strukturer och har derivatiserats med en fluorescerande reporter. Ett viktigt exempel på denna klass av fluorescerande fläckar är falloidin , som används för att färga aktinfibrer i däggdjursceller . En ny peptid, känd som Collagen Hybridizing Peptide , kan också konjugeras med fluoroforer och användas för att färga denaturerade kollagenfibrer. Färgning av växtcellväggarna utförs med hjälp av fläckar eller färgämnen som binder cellulosa eller pektin . Jakten på fluorescerande sonder med en hög specificitet som också möjliggör levande avbildning av växtceller pågår.

Det finns många fluorescerande molekyler som kallas fluoroforer eller fluorokromer som fluorescein , Alexa Fluors eller DyLight 488 , som kan vara kemiskt kopplade till en annan molekyl som binder målet för intresset i provet.

Immunfluorescens

Immunfluorescens är en teknik som använder den högspecifika bindningen av en antikropp till dess antigen för att märka specifika proteiner eller andra molekyler i cellen. Ett prov behandlas med en primär antikropp specifik för molekylen av intresse. En fluorofor kan konjugeras direkt till den primära antikroppen. Alternativt kan en sekundär antikropp , konjugerad till en fluorofor, som specifikt binder till den första antikroppen användas. Till exempel kan en primär antikropp som alstras i en mus som känner igen tubulin i kombination med en sekundär antimus-antikropp derivatiserad med en fluorofor användas för att märka mikrotubuli i en cell.

Fluorescerande proteiner

Den moderna förståelsen av genetik och de tekniker som finns tillgängliga för att modifiera DNA gör det möjligt för forskare att genetiskt modifiera proteiner för att också bära en fluorescerande proteinreporter. I biologiska prover tillåter detta en forskare att direkt göra ett protein av intresse fluorescerande. Proteinplatsen kan sedan spåras direkt, inklusive i levande celler.

Begränsningar

Fluoroforer förlorar sin förmåga att lysa genom att de belyses i en process som kallas fotoblekning . Fotoblekning sker när de fluorescerande molekylerna ackumulerar kemisk skada från elektronerna som exciteras under fluorescens. Fotoblekning kan allvarligt begränsa den tid under vilken ett prov kan observeras genom fluorescensmikroskopi. Flera tekniker finns för att minska fotoblekning såsom användning av mer robusta fluoroforer, genom att minimera belysning, eller genom att använda fotoskyddande renhållare kemikalier.

Fluorescensmikroskopi med fluorescerande reporterproteiner har möjliggjort analys av levande celler genom fluorescensmikroskopi, men celler är mottagliga för fototoxicitet, särskilt med ljus med kort våglängd. Dessutom har fluorescerande molekyler en tendens att generera reaktiva kemiska arter när de är under belysning vilket ökar den fototoxiska effekten.

Till skillnad från transmitterade och reflekterade ljusmikroskopitekniker tillåter fluorescensmikroskopi endast observation av de specifika strukturer som har märkts för fluorescens. Exempelvis avslöjar observering av ett vävnadsprov framställt med en fluorescerande DNA -fläck genom fluorescensmikroskopi endast organisationen av DNA i cellerna och avslöjar inget annat om cellmorfologierna.

Beräkningstekniker som föreslår att uppskatta den fluorescerande signalen från icke-fluorescerande bilder (t.ex. brightfield) kan minska dessa problem. I allmänhet innebär dessa tillvägagångssätt att träna ett djupt konvolutionsnervnätverk på färgade celler och sedan uppskatta fluorescensen på ofärgade prover. Genom att koppla bort cellerna som undersöks från cellerna som används för att träna nätverket kan avbildning utföras snabbare och med minskad fototoxicitet.

Sub-diffraktionstekniker

Ljusets vågkaraktär begränsar storleken på den plats till vilken ljuset kan fokuseras på grund av diffraktionsgränsen . Denna begränsning beskrevs på 1800 -talet av Ernst Abbe och "begränsar ett optiskt mikroskops upplösning till ungefär hälften av det använda ljusets våglängd." Fluorescensmikroskopi är centralt för många tekniker som syftar till att nå förbi denna gräns med specialiserade optiska konfigurationer.

Flera förbättringar av mikroskopitekniker har uppfunnits under 1900 -talet och har resulterat i ökad upplösning och kontrast till viss del. Men de övervann inte diffraktionsgränsen. År 1978 har de första teoretiska idéerna utvecklats för att bryta denna barriär genom att använda ett 4Pi-mikroskop som ett konfokalt laserskannande fluorescensmikroskop där ljuset idealiskt fokuseras från alla sidor till ett gemensamt fokus som används för att skanna objektet genom 'punkt-för- punkt 'excitation i kombination med' punkt-för-punkt 'detektion. Den första experimentella demonstrationen av 4pi-mikroskopet ägde dock rum 1994. 4Pi-mikroskopi maximerar mängden tillgängliga fokusriktningar genom att använda två motsatta objektiv eller tvåfoton-excitationsmikroskopi med rött skiftat ljus och multifoton-excitation.

Integrerad korrelativ mikroskopi kombinerar ett fluorescensmikroskop med ett elektronmikroskop. Detta gör att man kan visualisera ultrastruktur och kontextuell information med elektronmikroskopet medan man använder data från fluorescensmikroskopet som ett märkningsverktyg.

Den första tekniken för att verkligen uppnå en sub-diffraktionsupplösning var STED-mikroskopi , föreslagen 1994. Denna metod och alla tekniker som följer RESOLFT- konceptet är beroende av en stark olinjär interaktion mellan ljus och fluorescerande molekyler. Molekylerna drivs starkt mellan urskiljbara molekylära tillstånd vid varje specifik plats, så att slutligen ljus kan sändas ut endast i en liten del av rymden, därav en ökad upplösning.

Likaså under 1990 -talet har en annan superupplöst mikroskopimetod som är baserad på mikroskopi i stort fält utvecklats. Väsentligt förbättrad storleksupplösning av cellulära nanostrukturer färgade med en fluorescerande markör uppnåddes genom utveckling av SPDM -lokaliseringsmikroskopi och den strukturerade laserbelysningen (rumsligt modulerad belysning, SMI). Att kombinera SPDM -principen med SMI resulterade i utvecklingen av Vertico SMI -mikroskop . Enmolekyldetektering av normala blinkande fluorescerande färgämnen som grönt fluorescerande protein (GFP) kan uppnås genom att använda en vidareutveckling av SPDM den så kallade SPDMphymod-tekniken som gör det möjligt att detektera och räkna två olika fluorescerande molekyltyper på molekylnivå (detta teknik kallas tvåfärgs lokaliseringsmikroskopi eller 2CLM).

Alternativt kan tillkomsten av fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi uppnå liknande resultat genom att förlita sig på blinkande eller byte av enstaka molekyler, där fraktionen av fluorescerande molekyler är mycket liten vid varje tidpunkt. Detta stokastiska svar av molekyler på det applicerade ljuset motsvarar också en mycket olinjär interaktion, vilket leder till subdiffraktionsupplösning.

Fluorescensmikrografgalleri

Se även

Referenser

externa länkar