Total intern reflektionsfluorescensmikroskop - Total internal reflection fluorescence microscope

(Cis-) diagram för total intern reflektionsfluorescensmikroskop (TIRFM)
  1. Prov
  2. Evanescent vågområde
  3. Täckglas
  4. Nedsänkningsolja
  5. Mål
  6. Utsläppsstråle (signal)
  7. Excitationsstråle
(Trans-) total intern reflektion fluorescensmikroskop (TIRFM) diagram
  1. Mål
  2. Utsläppsstråle (signal)
  3. Nedsänkningsolja
  4. Täckglas
  5. Prov
  6. Evanescent vågområde
  7. Excitationsstråle
  8. Kvartsprisma

En total inre reflektion fluorescensmikroskop ( TIRFM ) är en typ av mikroskop med vilken en tunn region i ett prov, vanligen kan mindre än 200 nanometer observer .

Bakgrund

Inom cell- och molekylärbiologi har ett stort antal molekylära händelser i cellulära ytor såsom cellvidhäftning , bindning av celler genom hormoner , utsöndring av neurotransmittorer och membrandynamik studerats med konventionella fluorescensmikroskop . Emellertid fluoroforer som är bundna till provytan och de i det omgivande mediet existerar i ett jämviktstillstånd. När dessa molekyler exciteras och detekteras med ett konventionellt fluorescensmikroskop, blir den resulterande fluorescensen från de fluoroforer bundna till ytan ofta överväldigad av bakgrundsfluorescensen på grund av den mycket större populationen av icke bundna molekyler. TIRFM möjliggör selektiv excitation av de ytbundna fluoroforerna, medan icke-bundna molekyler inte är upphetsade och inte fluorescerar. TIRFM har blivit en metod för val för detektering av enmolekyl på grund av submikrons ytselektivitet.

Översikt

Idén att använda total intern reflektion för att belysa celler som kommer i kontakt med glasytan beskrevs först av EJ Ambrose 1956. Idén utvidgades sedan av Daniel Axelrod vid University of Michigan, Ann Arbor i början av 1980-talet som TIRFM. En TIRFM använder en evanescent våg för att selektivt belysa och excitera fluoroforer i ett begränsat område av provet omedelbart intill glas-vatten-gränssnittet. Det evanescerande elektromagnetiska fältet sönderfaller exponentiellt från gränssnittet och tränger sålunda in till ett djup av endast cirka 100 nm in i provmediet. Således möjliggör TIRFM en selektiv visualisering av ytregioner såsom det basala plasmamembranet (som är cirka 7,5 nm tjockt) av celler som visas i figuren ovan. Observera dock att den visualiserade regionen är åtminstone några hundra nanometer bred, så den cytoplasmatiska zonen omedelbart under plasmamembranet visualiseras nödvändigtvis förutom plasmamembranet under TIRF-mikroskopi. Den selektiva visualiseringen av plasmamembranet gör funktionerna och händelserna på plasmamembranet i levande celler med hög axiell upplösning .

TIRF kan också användas för att observera fluorescensen hos en enda molekyl , vilket gör den till ett viktigt verktyg för biofysik och kvantitativ biologi. TIRF-mikroskopi har också tillämpats vid detektering av enstaka molekyler av DNA-biomarkörer och SNP-diskriminering.

Cis-geometri (genom-objektiv TIRFM) och trans-geometri (prisma- och ljusledarbaserad TIRFM) har visat sig ge olika kvalitet på effekten av total intern reflektion. När det gäller transgeometri separeras excitationsljusstigen och emissionskanalen, medan de i fallet med TIRFM av objektivtyp delar objektets och andra optiska element i mikroskopet. Prisma-baserad geometri visade sig generera ren evanescent våg, vilket exponentiellt förfall ligger nära den teoretiskt förutsagda funktionen. När det gäller objektivbaserad TIRFM är den försvinnande vågen emellertid förorenad med intensivt viloljus . Intensiteten hos tillfälligt ljus visade sig uppgå till 10-15% av den försvinnande vågen, vilket gör det svårt att tolka data som erhållits genom objektiv TIRFM

Referenser

externa länkar