Mikroskop - Microscope

Mikroskop
Sammansatt mikroskop (beskuren) .JPG
Mikroskop
Användningsområden Liten provobservation
Anmärkningsvärda experiment Upptäckt av celler
Relaterade saker Optiskt mikroskop Elektronmikroskop

Ett mikroskop (från forntida grekisk : μικρός mikros 'små' och σκοπεῖν skopeîn 'till utseende (at); undersöka, inspektera') är en laboratorieinstrument används för att undersöka objekt som är för små för att ses med blotta ögat . Mikroskopi är vetenskapen om att undersöka små föremål och strukturer med hjälp av ett mikroskop. Mikroskopisk betyder att vara osynlig för ögat om det inte får hjälp av ett mikroskop.

Det finns många typer av mikroskop, och de kan grupperas på olika sätt. Ett sätt är att beskriva metoden ett instrument användningar för att interagera med ett prov och producera bilder, antingen genom att skicka en stråle av ljus eller elektroner genom ett prov i dess optiska banan , genom att detektera foton utsläpp från ett prov, eller genom att skanna över och en kort avstånd från ytan av ett prov med hjälp av en sond. Det vanligaste mikroskopet (och det första som uppfanns) är det optiska mikroskopet , som använder linser för att bryta synligt ljus som passerade genom ett tunt snittprov för att producera en observerbar bild. Andra huvudtyper av mikroskop är fluorescensmikroskop , elektronmikroskop (både transmissionselektronmikroskop och skanningselektronmikroskop ) och olika typer av scanningprobmikroskop .

Historia

1700-talets mikroskop från Musée des Arts et Métiers , Paris

Även om objekt som liknar linser går tillbaka till 4000 år och det finns grekiska berättelser om de optiska egenskaperna hos vattenfyllda sfärer (500-talet f.Kr.) följt av många århundraden av skrifter om optik, går den tidigaste kända användningen av enkla mikroskop ( förstoringsglas ) tillbaka till den utbredda användningen av linser i glasögon på 1200 -talet. De tidigaste kända exemplen på sammansatta mikroskop, som kombinerar en objektivlins nära exemplaret med ett okular för att se en verklig bild , dök upp i Europa omkring 1620. Uppfinnaren är okänd, även om många påståenden har gjorts genom åren. Flera kretsar kring glasögoncentralerna i Nederländerna , inklusive påståenden att det uppfanns 1590 av Zacharias Janssen (påstående från hans son) eller Zacharias far, Hans Martens, eller båda, hävdar att det uppfanns av deras granne och rivaliserande skådespel tillverkare, Hans Lippershey (som ansökte om det första teleskoppatentet 1608), och hävdar att det uppfanns av utlänningen Cornelis Drebbel , som noterades ha en version i London 1619. Galileo Galilei (även ibland citerad som sammansatt mikroskop uppfinnare) verkar att ha funnit efter 1610 att han kunde stänga fokus sitt teleskop för att se små föremål och, efter att ha sett ett sammansatt mikroskop byggt av Drebbel utställt i Rom 1624, byggt sin egen förbättrade version. Giovanni Faber myntade namnet mikroskop för det sammansatta mikroskopet Galileo som skickades till Accademia dei Lincei 1625 (Galileo hade kallat det occhiolino 'lilla ögat').

Uppkomsten av moderna ljusmikroskop

Carl Zeiss kikarmikroskop, 1914

Den första detaljerade redogörelsen för den mikroskopiska anatomin hos organisk vävnad baserad på användning av ett mikroskop visades inte förrän 1644, i Giambattista Odiernas L'occhio della mosca eller The Fly's Eye .

Mikroskopet var fortfarande i stort sett en nyhet fram till 1660- och 1670 -talen då naturforskare i Italien, Nederländerna och England började använda dem för att studera biologi. Italienska forskaren Marcello Malpighi , som kallades histologins fader av vissa biologiker, började sin analys av biologiska strukturer med lungorna. Publiceringen år 1665 av Robert Hooke s Micrographia haft en enorm inverkan, till stor del på grund av dess imponerande illustrationer. Ett betydande bidrag kom från Antonie van Leeuwenhoek som uppnådde upp till 300 gånger förstoring med ett enkelt enkellinsmikroskop. Han klämde in en mycket liten glasbollslins mellan hålen i två metallplattor nitade ihop, och med en justerbar skruvnål fäst för att montera provet. Sedan återupptäckte Van Leeuwenhoek röda blodkroppar (efter Jan Swammerdam ) och spermier , och hjälpte till att popularisera användningen av mikroskop för att se biologisk ultrastruktur. Den 9 oktober 1676 rapporterade van Leeuwenhoek upptäckten av mikroorganismer.

Ljusmikroskopets prestanda beror på kvaliteten och korrekt användning av kondensorlinssystemet för att fokusera ljuset på exemplaret och objektivlinsen för att fånga ljuset från exemplaret och bilda en bild. Tidiga instrument var begränsade tills denna princip var fullt uppskattad och utvecklad från slutet av 1800 -talet till mycket tidigt 1900 -tal, och tills elektriska lampor var tillgängliga som ljuskällor. År 1893 utvecklade Köhler en nyckelprincip för provbelysning, Köhler -belysning , som är central för att uppnå de teoretiska gränserna för upplösning för ljusmikroskopet. Denna metod för provbelysning ger jämn belysning och övervinner den begränsade kontrast och upplösning som tidiga provbelysningstekniker innebär. Ytterligare utveckling av provbelysning kom från upptäckten av faskontrast av Frits Zernike 1953 och differentiell interferenskontrastbelysning av Georges Nomarski 1955; båda möjliggör avbildning av ofärgade, transparenta prover.

Elektronmikroskop

Elektronmikroskop konstruerat av Ernst Ruska 1933

I början av 1900 -talet utvecklades ett betydande alternativ till ljusmikroskopet, ett instrument som använder en elektronstråle snarare än ljus för att generera en bild. Den tyska fysikern Ernst Ruska , som arbetade med elingenjör Max Knoll , utvecklade det första prototypen elektronmikroskop 1931, ett transmissionselektronmikroskop (TEM). Transmissionselektronmikroskopet fungerar på liknande principer som ett optiskt mikroskop men använder elektroner i stället för ljus och elektromagneter i stället för glaslinser. Användning av elektroner, istället för ljus, möjliggör mycket högre upplösning.

Utvecklingen av transmissionselektronmikroskopet följdes snabbt 1935 av utvecklingen av skanningselektronmikroskopet av Max Knoll . Även om TEM användes för forskning före andra världskriget och blev populär efteråt, var SEM inte kommersiellt tillgängligt förrän 1965.

Överföringselektronmikroskop blev populära efter andra världskriget . Ernst Ruska, som arbetar på Siemens , utvecklade det första kommersiella transmissionselektronmikroskopet och på 1950 -talet började stora vetenskapliga konferenser om elektronmikroskopi hållas. 1965 utvecklades det första kommersiella svepelektronmikroskopet av professor Sir Charles Oatley och hans doktorand Gary Stewart och marknadsfördes av Cambridge Instrument Company som "Stereoscan".

En av de senaste upptäckterna om att använda ett elektronmikroskop är förmågan att identifiera ett virus. Eftersom detta mikroskop ger en synlig, tydlig bild av små organeller, behövs det inte i ett elektronmikroskop reagenser för att se viruset eller skadliga celler, vilket resulterar i ett mer effektivt sätt att upptäcka patogener.

Skanning sond mikroskop

Från 1981 till 1983 arbetade Gerd Binnig och Heinrich RohrerIBM i Zürich , Schweiz för att studera kvanttunnelfenomenet . De skapade ett praktiskt instrument, ett skanningsmikroskop från kvanttunnelteori, som läste mycket små krafter som utbyts mellan en sond och ytan på ett prov. Sonden närmar sig ytan så nära att elektroner kan flöda kontinuerligt mellan sond och prov, vilket ger en ström från yta till sond. Mikroskopet mottogs initialt inte väl på grund av den komplexa karaktären hos de underliggande teoretiska förklaringarna. 1984 Jerry Tersoff och DR Hamann, medan på AT & T's Bell Laboratories i Murray Hill, New Jersey började publicera artiklar som knöt teori till de experimentella resultat som instrumentet erhöll. Detta följdes noga 1985 med fungerande kommersiella instrument, och 1986 med Gerd Binnig, Quate och Gerbers uppfinning av atomkraftmikroskopet , sedan Binnigs och Rohrers Nobelpris i fysik för SPM.

Nya typer av skanningsmikroskop har fortsatt att utvecklas eftersom förmågan att bearbeta ultrafina sonder och spetsar har avancerat.

Fluorescensmikroskop

Fluorescensmikroskop med filterkubtornet ovanför objektivlinserna, tillsammans med en kamera.

Den senaste utvecklingen inom ljusmikroskop fokuserar till stor del på ökningen av fluorescensmikroskopi i biologin . Under 1900-talets sista decennier, särskilt under den post- genomiska eran, utvecklades många tekniker för fluorescerande färgning av cellulära strukturer. Huvudgrupperna av tekniker involverar riktad kemisk färgning av särskilda cellstrukturer, till exempel den kemiska föreningen DAPI för att märka DNA , användning av antikroppar konjugerade till fluorescerande reportrar, se immunfluorescens och fluorescerande proteiner, såsom grönt fluorescerande protein . Dessa tekniker använder dessa olika fluoroforer för analys av cellstruktur på molekylär nivå i både levande och fasta prover.

Ökningen av fluorescensmikroskopi drev utvecklingen av en stor modern mikroskopdesign, det konfokala mikroskopet . Principen patenterades 1957 av Marvin Minsky , även om lasertekniken begränsade praktisk tillämpning av tekniken. Det var inte förrän 1978 när Thomas och Christoph Cremer utvecklade det första praktiska konfokala laserskanningsmikroskopet och tekniken blev snabbt populär genom 1980 -talet.

Superupplösta mikroskop

Mycket aktuell forskning (i början av 2000 -talet) på optiska mikroskoptekniker är inriktad på utveckling av superresolutionsanalys av fluorescensmärkta prover. Strukturerad belysning kan förbättra upplösningen med cirka två till fyra gånger och tekniker som stimulerad utsläppsminskning (STED) mikroskopi närmar sig upplösningen av elektronmikroskop. Detta inträffar eftersom diffraktionsgränsen uppstår från ljus eller excitation, vilket gör att upplösningen måste fördubblas för att bli supermättad. Stefan Hell tilldelades 2014 Nobelpriset i kemi för utvecklingen av STED-tekniken, tillsammans med Eric Betzig och William Moerner som anpassade fluorescensmikroskopi för enmolekylär visualisering.

Röntgenmikroskop

Röntgenmikroskop är instrument som använder elektromagnetisk strålning vanligtvis i det mjuka röntgenbandet till bildobjekt. Tekniska framsteg inom röntgenlinsoptik i början av 1970-talet gjorde instrumentet till ett livskraftigt bildval. De används ofta inom tomografi (se mikroberäknad tomografi ) för att producera tredimensionella bilder av föremål, inklusive biologiska material som inte har fixerats kemiskt. För närvarande forskas för att förbättra optiken för hårda röntgenstrålar som har större penetrationskraft.

Typer

Typer av mikroskop som illustreras av principerna för deras strålvägar
Utveckling av rumsupplösning uppnådd med optiska, överförings (TEM) och aberrationskorrigerade elektronmikroskop (ACTEM).

Mikroskop kan delas in i flera olika klasser. En gruppering är baserad på vad som interagerar med provet för att generera bilden, dvs ljus eller fotoner (optiska mikroskop), elektroner (elektronmikroskop) eller en sond (skanningssondmikroskop). Alternativt kan mikroskop klassificeras baserat på om de analyserar provet via en skanningspunkt (konfokala optiska mikroskop, skanningselektronmikroskop och skanningssondmikroskop) eller analyserar provet på en gång (brett fält optiska mikroskop och transmissionselektronmikroskop).

Bredfält optiska mikroskop och transmissionselektronmikroskop använder båda teorin om linser ( optik för ljusmikroskop och elektromagnetlinser för elektronmikroskop) för att förstora bilden som genereras av passage av en våg som överförs genom provet, eller reflekteras av provet. Vågorna som används är elektromagnetiska (i optiska mikroskop ) eller elektronstrålar (i elektronmikroskop ). Upplösningen i dessa mikroskop begränsas av våglängden för strålningen som används för att avbilda provet, där kortare våglängder möjliggör en högre upplösning.

Skanning av optiska och elektronmikroskop, som konfokalmikroskop och skanningselektronmikroskop, använder linser för att fokusera en ljuspunkt eller elektroner på provet och analysera sedan signalerna som genereras av strålen som interagerar med provet. Punkten skannas sedan över provet för att analysera ett rektangulärt område. Förstoring av bilden uppnås genom att visa data från skanning av ett fysiskt litet provområde på en relativt stor skärm. Dessa mikroskop har samma upplösningsgräns som bredfältoptiska, sond- och elektronmikroskop.

Skanningssondmikroskop analyserar också en enda punkt i provet och skannar sedan sonden över ett rektangulärt provområde för att bygga upp en bild. Eftersom dessa mikroskop inte använder elektromagnetisk eller elektronstrålning för avbildning är de inte föremål för samma upplösningsgräns som de optiska och elektronmikroskop som beskrivs ovan.

Optisk

Den vanligaste typen av mikroskop (och det första som uppfanns) är det optiska mikroskopet . Detta är ett optiskt instrument som innehåller en eller flera linser som producerar en förstorad bild av ett prov placerat i brännplanet. Optiska mikroskop har brytningsglas (ibland plast eller kvarts ), för att fokusera ljuset på ögat eller vidare till en annan ljusdetektor. Spegelbaserade optiska mikroskop fungerar på samma sätt. Typisk förstoring av ett ljusmikroskop, med antagande av synligt ljus, är upp till 1250x med en teoretisk upplösningsgräns på cirka 0,250  mikrometer eller 250  nanometer . Detta begränsar praktisk förstoring till ~ 1500x. Specialiserade tekniker (t.ex. skanning av konfokalmikroskopi , Vertico SMI ) kan överstiga denna förstoring men upplösningen är diffraktionsbegränsad . Användningen av kortare våglängder av ljus, såsom ultraviolett, är ett sätt att förbättra det optiska mikroskopets rumsliga upplösning, liksom enheter som det optiska mikroskopet för närfältskanning .

Sarfus är en ny optisk teknik som ökar känsligheten hos ett standardoptiskt mikroskop till en punkt där det är möjligt att direkt visualisera nanometriska filmer (ner till 0,3 nanometer) och isolerade nanoobjekt (ner till 2 nm-diameter). Tekniken är baserad på användning av icke-reflekterande substrat för korspolariserat reflekterat ljusmikroskopi.

Ultraviolett ljus möjliggör upplösning av mikroskopiska funktioner samt avbildning av prover som är transparenta för ögat. Nära infrarött ljus kan användas för att visualisera kretsar inbäddade i bundna kiselanordningar, eftersom kisel är transparent i detta område med våglängder.

I fluorescensmikroskopi kan många våglängder av ljus som sträcker sig från ultraviolett till det synliga användas för att få prover att fluorescera , vilket möjliggör visning med ögat eller med specifikt känsliga kameror.

Ofärgade celler ses av typiskt ljusfält (vänster) jämfört med fas-kontrastmikroskopi (höger).

Fas-kontrastmikroskopi är en optisk mikroskopisk belysningsteknik där små fasskiftningar i ljuset som passerar genom ett transparent prov omvandlas till amplitud- eller kontrastförändringar i bilden. Användningen av faskontrast kräver inte färgning för att se bilden. Denna mikroskopteknik gjorde det möjligt att studera cellcykeln i levande celler.

Det traditionella optiska mikroskopet har nyligen utvecklats till det digitala mikroskopet . Förutom, eller i stället för, att direkt se objektet genom okularen , används en typ av sensor som liknar den som används i en digitalkamera för att få en bild, som sedan visas på en datorskärm. Dessa sensorer kan använda CMOS eller laddningskopplad enhet (CCD) -teknologi, beroende på applikationen.

Digital mikroskopi med mycket låga ljusnivåer för att undvika skador på sårbara biologiska prover finns tillgängligt med känsliga fotonräknande digitalkameror. Det har visats att en ljuskälla som tillhandahåller par med intrasslade fotoner kan minimera risken för skador på de mest ljuskänsliga proverna. I denna tillämpning av spökbildning till foton-gles mikroskopi belyses provet med infraröda fotoner, som var och en är rumsligt korrelerad med en intrasslad partner i det synliga bandet för effektiv avbildning med en fotonräknande kamera.

Modernt transmissionselektronmikroskop

Elektron

Överföringselektronmikrograf av en delande cell som genomgår cytokines

De två huvudtyperna av elektronmikroskop är transmissionselektronmikroskop (TEM) och skanningelektronmikroskop (SEM). De har båda serier av elektromagnetiska och elektrostatiska linser för att fokusera en hög energistråle av elektroner på ett prov. I en TEM passerar elektronerna genom provet, analogt med grundläggande optisk mikroskopi . Detta kräver noggrann provberedning, eftersom elektroner sprids starkt av de flesta material. Proverna måste också vara mycket tunna (under 100 nm) för att elektronerna ska passera genom den. Tvärsnitt av celler färgade med osmium och tungmetaller avslöjar tydliga organellmembran och proteiner som ribosomer. Med en upplösning på 0,1 nm kan detaljerade visningar av virus (20 - 300 nm) och en DNA -sträng (2 nm i bredd) erhållas. Däremot har SEM raster -spolar för att skanna ytan på bulkobjekt med en fin elektronstråle. Därför behöver provet inte nödvändigtvis snittas, men beläggning med ett nanometriskt metall- eller kolskikt kan behövas för icke -ledande prover. SEM tillåter snabb ytavbildning av prover, eventuellt i tunn vattenånga för att förhindra torkning.

Skanningssond

De olika typerna av skanningssondmikroskop härrör från de många olika typerna av interaktioner som uppstår när en liten sond skannas över och interagerar med ett prov. Dessa interaktioner eller lägen kan registreras eller kartläggas som funktion av plats på ytan för att bilda en karakteriseringskarta. De tre vanligaste typerna av skanningssondmikroskop är atomkraftmikroskop (AFM), optiska mikroskop för nära fält (MSOM eller SNOM, skanning av nära fältmikroskopi) och skanning av tunnelmikroskop (STM). Ett atomkraftmikroskop har en fin sond, vanligtvis av kisel eller kiselnitrid, fäst vid en cantilever; sonden skannas över provets yta och krafterna som orsakar en interaktion mellan sonden och ytan på provet mäts och kartläggs. Ett optiskt mikroskop för närfältskanning liknar ett AFM men dess sond består av en ljuskälla i en optisk fiber täckt med en spets som vanligtvis har en bländare för ljuset att passera igenom. Mikroskopet kan fånga antingen överfört eller reflekterat ljus för att mäta mycket lokaliserade optiska egenskaper hos ytan, vanligen av ett biologiskt prov. Skanningstunnelmikroskop har en metallspets med en enda apikal atom; spetsen är fäst vid ett rör genom vilket en ström strömmar. Spetsen skannas över ytan på ett ledande prov tills en tunnelström flödar; strömmen hålls konstant genom datorrörelse av spetsen och en bild bildas av spetsens inspelade rörelser.

Bladytan betraktad av ett svepelektronmikroskop.

Andra typer

Skanning av akustiska mikroskop använder ljudvågor för att mäta variationer i akustisk impedans. I likhet med ekolod används de i princip för jobb som att upptäcka defekter i materialets underytor inklusive de som finns i integrerade kretsar. Den 4 februari 2013 byggde australiensiska ingenjörer ett "kvantmikroskop" som ger oöverträffad precision.

Se även

Referenser

Första atomkraftsmikroskop

externa länkar