RESOLFT - RESOLFT

RESOLFT , en förkortning för RE versible S aturable O ptica L F luorescence T ransitions, betecknar en grupp optiska fluorescensmikroskopitekniker med mycket hög upplösning. Med hjälp av optik för synligt ljus för långt fjärrfält kan en upplösning långt under diffraktionsgränsen ner till molekylära skalor erhållas.

Med konventionella mikroskopitekniker är det inte möjligt att särskilja funktioner som är belägna på avstånd som är mindre än ungefär hälften av den använda våglängden (dvs. cirka 200 nm för synligt ljus ). Denna diffraktionsgräns är baserad på ljusets vågkaraktär . I konventionella mikroskop bestäms gränsen av den använda våglängden och den numeriska bländaren för det optiska systemet. RESOLFT-konceptet överstiger denna gräns genom att tillfälligt byta molekylerna till ett tillstånd där de inte kan skicka en (fluorescens-) signal vid belysning. Detta koncept skiljer sig från till exempel elektronmikroskopi där den använda våglängden istället är mycket mindre.

Arbetsprincip

RESOLFT -mikroskopi är en optisk mikroskopi med mycket hög upplösning som kan avbilda detaljer i prover som inte kan avbildas med konventionell eller konfokal mikroskopi . Inom RESOLFT är principerna för STED -mikroskopi och GSD -mikroskopi generaliserade. Strukturer som normalt ligger för nära varandra för att särskiljas läses upp sekventiellt.

Inom denna ram kan alla metoder förklaras som fungerar på molekyler som har minst två åtskillbara tillstånd, där reversibel växling mellan de två tillstånden är möjlig, och där minst en sådan övergång kan induceras optiskt.

I de flesta fall används fluorescerande markörer, där ett tillstånd (A) som är ljust, det vill säga genererar en fluorescenssignal, och det andra tillståndet (B) är mörkt, och ger ingen signal. En övergång mellan dem kan induceras av ljus (t.ex. A → B, ljus till mörk).

Provet belyses inhomogent med belysningsintensiteten vid en position mycket liten (noll under idealiska förhållanden). Endast på denna plats är molekylerna aldrig i det mörka tillståndet B (om A är det redan existerande tillståndet) och förblir helt i det ljusa tillståndet A. Området där molekylerna mestadels är i det ljusa tillståndet kan göras mycket små (mindre än den konventionella diffraktionsgränsen) genom att öka övergångsljusintensiteten (se nedan). Vilken signal som helst som detekteras är sålunda känd för att komma endast från molekyler i det lilla området kring minimumintensiteten för belysningsintensitet. En högupplöst bild kan konstrueras genom att skanna provet, dvs genom att flytta belysningsprofilen över ytan.

Övergången tillbaka från B till A kan antingen vara spontan eller drivs av ljus med en annan våglängd. Molekylerna måste kunna bytas flera gånger för att vara närvarande i tillstånd A eller B vid olika tidpunkter under avsökning av provet. Metoden fungerar också om det ljusa och mörka tillståndet är omvänt, man får då en negativ bild.

Upplösning under diffraktionsgränsen

RESOLFT -princip: Provet är inhomogent belyst (röd linje). Intensiteten reduceras i ett område som är jämförbart med den klassiska upplösningsgränsen, men är (helst) noll vid endast en position. Tröskelintensiteten (blå linje) som krävs för att växla molekylerna till det mörka tillståndet är bara en bråkdel av den maximala intensiteten som appliceras, så bara molekyler som är mycket nära positionen för minsta intensitet kan vara i det ljusa tillståndet. Det gröna området i den högra ramen illustrerar storleken på det område där molekyler kan generera en signal.

I RESOLFT kan området där molekylerna bor i tillstånd A (ljust tillstånd) göras godtyckligt litet trots diffraktionsgränsen.

• Man måste belysa provet inhomogent så att en isolerad nollintensitetspunkt skapas. Detta kan uppnås t.ex. genom störningar.
• Vid låg intensitet (lägre än den blå linjen i bilden) är de flesta markörmolekylerna i det ljusa tillståndet, om intensiteten är högre är de flesta markörerna i mörkt tillstånd.

Vid svag belysning ser vi att området där molekyler förblir i tillstånd A fortfarande är ganska stort eftersom belysningen är så låg att de flesta molekyler finns i tillstånd A. Formen på belysningsprofilen behöver inte ändras. Ökning av belysningens ljusstyrka resulterar redan i ett mindre område där intensiteten ligger under mängden för effektiv växling till det mörka tillståndet. Följaktligen minskas också området där molekyler kan bo i tillstånd A. Signalen (fluorescens) under en följande avläsning härstammar från en mycket liten fläck och man kan få mycket skarpa bilder.

I RESOLFT -konceptet kan upplösningen approximeras med , varigenom den karakteristiska intensitet som krävs för att mätta övergången (hälften av molekylerna förblir i tillstånd A och hälften i tillstånd B), och anger intensiteten som appliceras. Om minima produceras genom att fokusera optik med en numerisk bländare är det minimala avståndet på vilket två identiska objekt kan urskiljas som kan betraktas som en förlängning av Abbes ekvation. Diffraktionsobegränsad karaktär hos RESOLFT-konceptfamiljen återspeglas i det faktum att det minimala upplösbara avståndet kontinuerligt kan minskas genom att öka . Därför kommer strävan efter nanoskalaupplösning att maximera denna mängd. Detta är möjligt genom att öka eller sänka . ${\ displaystyle \ Delta d \ simeq {\ frac {\ lambda} {\ pi n {\ sqrt {\ frac {I} {Isat}}}}}}}$${\ displaystyle I_ {lör}}$${\ displaystyle I}$${\ displaystyle {\ mbox {NA}} = n \ sin \ alpha}$${\ displaystyle \ Delta d = {\ frac {\ lambda} {2n \ cdot \ sin \ alpha \ cdot {\ sqrt {1+{\ frac {I} {Isat}}}}}}}}}}$${\ displaystyle \ Delta d}$${\ displaystyle \ varsigma = {\ frac {I} {Isat}}}$${\ displaystyle I}$${\ displaystyle I_ {lör}}$

Varianter

Olika processer används när man byter molekylära tillstånd. Men alla har det gemensamt att minst två urskiljbara tillstånd används. Typiskt markerar fluorescensegenskapen som används skillnaderna mellan staterna, men detta är inte nödvändigt, eftersom absorptions- eller spridningsegenskaper också kan utnyttjas.

STED -mikroskopi

(Huvudartikel STED -mikroskopi )

Inom STED -mikroskopin (STimulated Emission Depletion microscopy) drivs en fluorescerande färgmolekyl mellan dess elektroniska grundtillstånd och dess upphetsade tillstånd medan den skickar ut fluorescensfotoner. Detta är standardoperationsläget i fluorescensmikroskopi och visar tillstånd A. I tillstånd B hålls färgämnet permanent i sitt elektroniska grundtillstånd genom stimulerad emission . Om färgämnet kan fluorescera i tillstånd A och inte i tillstånd B, gäller RESOLFT -konceptet.

GSD -mikroskopi

(Huvudartikel GSD -mikroskopi )

GSD -mikroskopi (Ground State Depletion microscopy) använder också fluorescerande markörer. I tillstånd A kan molekylen fritt drivas mellan marken och det första exciterade tillståndet och fluorescens kan skickas ut. I det mörka tillståndet B avfolkas molekylens grundtillstånd, en övergång till ett långlivat upphetsat tillstånd sker från vilket fluorescens inte avges. Så länge molekylen är i mörkt tillstånd, är den inte tillgänglig för cykling mellan mark och exciterat tillstånd, fluorescens är därför avstängd.

SPEM och SSIM

SPEM (Saturated Pattern Excitation Microscopy) och SSIM (Saturated Structured Illumination Microscopy) utnyttjar RESOLFT -konceptet med mättad excitation för att producera "negativa" bilder, dvs fluorescens sker överallt utom i en mycket liten region runt mikroskopets geometriska fokus. Också icke-punktliknande mönster används för belysning. Matematisk bildrekonstruktion är nödvändig för att få positiva bilder igen.

RESOLFT med omkopplingsbara proteiner

Vissa fluorescerande proteiner kan slås på och av med ljus med en lämplig våglängd. De kan användas i ett mikroskop av RESOLFT-typ. Under belysning med ljus ändrar dessa proteiner sin form. I processen får de eller förlorar sin förmåga att avge fluorescens. Fluorescerande tillstånd motsvarar tillstånd A, icke-fluorescerande till tillstånd B och RESOLFT-konceptet gäller igen. Den reversibla övergången (t.ex. från B tillbaka till A) sker antingen spontant eller igen drivs av ljus. Framkallande konformationsförändringar i proteiner kan uppnås redan vid mycket lägre kopplingsljusintensiteter jämfört med stimulerad utsläpp eller utarmning av marktillstånd (en del W/cm²). I kombination med 4Pi -mikroskopi har bilder med isotrop upplösning under 40 nm tagits av levande celler vid låga ljusnivåer.

RESOLFT med växlingsbara organiska färgämnen

Precis som med proteiner kan även vissa organiska färgämnen ändra sin struktur vid belysning. Möjligheten att fluorescera sådana organiska färgämnen kan slås på och av genom synligt ljus. Återigen kan den applicerade ljusintensiteten vara ganska låg (cirka 100 W/cm²).

Referenser