Antibiotisk känslighetstestning - Antibiotic sensitivity testing

Exempel på antibiotikakänslighetstestning. Tunna papperskivor som innehåller ett antibiotikum har placerats på en agarplatta som växer bakterier . Bakterier kan inte växa runt antibiotika som de är känsliga för. Detta kallas "hämningszonen".

Antibiotikakänslighetstestning eller antibiotikakänslighetstestning är mätning av bakteriers mottaglighet för antibiotika . Det används eftersom bakterier kan ha resistens mot vissa antibiotika. Känslighetstestresultat kan göra det möjligt för en läkare att ändra valet av antibiotika från empirisk terapi , vilket är när ett antibiotikum väljs utifrån klinisk misstanke om infektionsstället och vanliga orsakande bakterier, till riktad terapi , där valet av antibiotika är baserat på kunskap om organismen och dess känsligheter.

Känslighetstestning sker vanligtvis i ett medicinskt laboratorium och använder odlingsmetoder som utsätter bakterier för antibiotika eller genetiska metoder som testar om bakterier har gener som ger resistens. Odlingsmetoder innebär ofta att man mäter diametern på områden utan bakterietillväxt, kallade hämningszoner, runt papperskivor som innehåller antibiotika på agarodlingsrätter som har jämnt ympats med bakterier. Den minsta hämmande koncentrationen , som är den lägsta koncentrationen av antibiotikumet som stoppar bakterietillväxten, kan uppskattas utifrån storleken på hämningszonen.

Antibiotikakänslighetstest har behövts sedan upptäckten av beta-laktam antibiotikum penicillin . Initiala metoder var fenotypiska och involverade odling eller utspädning. Den Etest , ett antibiotikum impregnerad remsa, har varit tillgänglig sedan 1980-talet, och genetiska metoder såsom polymeraskedjereaktion (PCR) testning har varit tillgängliga sedan början av 2000-talet. Forskning pågår för att förbättra nuvarande metoder genom att göra dem snabbare eller mer exakta, liksom att utveckla nya metoder för testning, till exempel mikrofluidik .

Användningsområden

Inom klinisk medicin förskrivs antibiotika oftast på grundval av en persons symptom och medicinska riktlinjer . Denna metod för antibiotikaval kallas empirisk terapi , och den är baserad på kunskap om vilka bakterier som orsakar en infektion, och till vilka antibiotika bakterier kan vara känsliga eller resistenta. Till exempel kan en enkel urinvägsinfektion behandlas med trimetoprim/sulfametoxazol . Detta beror på att Escherichia coli är den mest sannolika orsakande bakterien och kan vara känslig för den kombinationen antibiotika . Bakterier kan dock vara resistenta mot flera klasser av antibiotika . Denna resistens kan bero på att en typ av bakterier har inneboende resistens mot vissa antibiotika, på grund av resistens efter tidigare exponering för antibiotika, eller att resistens kan överföras från andra källor som plasmider . Antibiotikakänslighetstest ger information om vilka antibiotika som är mer benägna att bli framgångsrika och bör därför användas för att behandla infektionen.

Antibiotikakänslighetstest utförs också på befolkningsnivå i vissa länder som en form av screening . Detta för att bedöma bakgrundsfrekvensen för resistens mot antibiotika (till exempel med meticillinresistent Staphylococcus aureus ) och kan påverka riktlinjer och folkhälsoåtgärder .

Metoder

När en bakterie väl har identifierats efter mikrobiologisk odling väljs antibiotika ut för känslighetstestning. Känslighetsprovningsmetoder är baserade på att utsätta bakterier för antibiotika och observera effekten på bakteriens tillväxt (fenotypisk testning) eller identifiera specifika genetiska markörer (genetisk testning). Metoder som används kan vara kvalitativa, vilket innebär att ett resultat indikerar att motstånd är eller inte är närvarande; eller kvantitativ, med användning av en minsta inhiberande koncentration (MIC) för att beskriva koncentrationen av antibiotika för vilken en bakterie är känslig.

Det finns många faktorer som kan påverka resultaten av antibiotikakänslighetstestning, inklusive fel på instrumentet, temperatur, fukt och styrka hos det antimikrobiella medlet. Kvalitetskontroll (QC) -testning hjälper till att säkerställa noggrannheten i testresultaten. Organisationer som American Type Culture Collection och National Collection of Type Cultures ger bakteriestammar kända resistensfenotyper som kan användas för kvalitetskontroll.

Fenotypiska metoder

Från vänster till höger: 0,5, 1 och 2 McFarland -standarder

Test baserat på att utsätta bakterier för antibiotika använder agarplattor eller utspädning i agar eller buljong. Valet av antibiotika beror på den organism som odlas och de antibiotika som finns tillgängliga lokalt. För att säkerställa att resultaten är korrekta måste koncentrationen av bakterier som tillsätts agaren eller buljongen ( inokulatet ) standardiseras. Detta uppnås genom att jämföra grumligheten hos bakterier suspenderade i saltlösning eller buljong med McFarland -standarder - lösningar vars grumlighet motsvarar den för en suspension som innehåller en given bakteriekoncentration. När en lämplig koncentration (vanligtvis en 0,5 McFarland -standard) har uppnåtts, vilken kan bestämmas genom visuell inspektion eller med fotometri , tillsätts inokulatet till tillväxtmediet .

Manuell

Den skiva diffusion metod innebär att välja en stam av bakterier, att placera den på en agarplatta, och observera bakteriell tillväxt i närheten av antibiotikaimpregnerade skivor. Detta kallas också Kirby-Bauer-metoden , även om modifierade metoder också används. I vissa fall appliceras urinprov eller positiva blododlingsprov direkt på testmediet, vilket går förbi det inledande steget att isolera organismen. Om antibiotikumet hämmar mikrobiell tillväxt, ses en tydlig ring eller hämningszon runt skivan. Bakterierna klassificeras som känsliga, mellanliggande eller resistenta mot ett antibiotikum genom att jämföra hämningszonens diameter med definierade trösklar som korrelerar med MIC.

Exempel på en Etest , som använder en plastremsa impregnerad med ett antibiotikum i olika koncentrationer

Mueller-Hinton-agar används ofta i skivdiffusionstestet. Den Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) och Europeiska kommittén on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) tillhandahåller standarder för typen och djupet av agar, inkubationstemperaturen, och metod för analys av resultaten. Skivdiffusion anses vara den billigaste och enklaste av de metoder som används för att testa känslighet och är lätt anpassad för att testa nyligen tillgängliga antibiotika eller formuleringar. Vissa långsamt växande och kräsna bakterier kan inte testas exakt med denna metod, medan andra, såsom Streptococcus- arter och Haemophilus influenzae , kan testas men kräver specialiserade tillväxtmedier och inkubationsförhållanden.

Gradientmetoder, såsom Etest , använder en plastremsa placerad på agar. En plastremsa impregnerad med olika koncentrationer av antibiotika placeras på ett tillväxtmedium och tillväxtmediet ses efter en period av inkubation. Den lägsta hämmande koncentrationen kan identifieras baserat på skärningspunkten mellan den tårformade hämningszonen och markeringen på remsan. Flera remsor för olika antibiotika kan användas. Denna typ av test anses vara ett diffusionstest.

I metoder för utspädning av agar och buljong placeras bakterier i flera små rör med olika koncentrationer av antibiotika. Om en bakterie är känslig eller inte avgörs genom visuell inspektion eller automatiska optiska metoder, efter en period av inkubation. Buljongspädning anses vara guldstandarden för fenotypisk testning. Den lägsta koncentrationen av antibiotika som hämmar tillväxten anses vara MIC.

Automatiserad

Vänster: Förformulerade antibiotikapaneler laddade i ett instrument som används för automatiserad antibiotikakänslighetstestning. Höger: En laboratoriearbetare granskar känslighetsresultat som visas på skärmen i den automatiska analysatorn.

Det finns automatiserade system som replikerar manuella processer, till exempel genom att använda bildbehandling och mjukvaroanalys för att rapportera inhiberingszonen vid diffusionstestning, eller att utdela prover och bestämma resultat i utspädningstestning. Automatiserade instrument, som VITEK 2, BD Phoenix och Microscan -system, är den vanligaste metoden för AST. Specifikationerna för varje instrument varierar, men grundprincipen innebär införande av en bakteriesuspension i förformulerade paneler av antibiotika. Panelerna inkuberas och hämningen av bakterietillväxt av antibiotikumet mäts automatiskt med hjälp av metoder som turbidimetri , spektrofotometri eller fluorescensdetektering . Ett expertsystem korrelerar MIC med känslighetsresultat, och resultaten överförs automatiskt till laboratorieinformationssystemet för validering och rapportering. Även om sådan automatiserad testning är mindre arbetskrävande och mer standardiserad än manuell testning, kan dess noggrannhet vara relativt dålig för vissa organismer och antibiotika, så skivdiffusionstestet är fortfarande användbart som en backupmetod.

Genetiska metoder

Genetiska tester, såsom via polymeraskedjereaktion (PCR), DNA-mikroarray , DNA-chips och loop-medierad isoterm amplifiering , kan användas för att detektera om bakterier har gener som ger antibiotikaresistens. Ett exempel är användningen av PCR för att detektera mecA genen för beta-laktam resistent Staphylococcus aureus . Andra exempel inkluderar analyser för testning av vancomycinresistensgener vanA och vanB i Enteroccocus -arter och antibiotikaresistens i Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumoniae och Escherichia coli . Dessa tester har fördelen att de är direkta och snabba jämfört med observerbara metoder och har stor sannolikhet att upptäcka ett fynd när det finns ett att upptäcka. Men om resistensgener detekteras stämmer inte alltid med resistensprofilen som ses med fenotypisk metod. Testerna är också dyra och kräver specialutbildad personal.

Polymeras kedjereaktion är en metod för att identifiera gener relaterade till antibiotikakänslighet. I PCR -processen denatureras en bakteries DNA och de två strängarna i dubbelhelixen separeras. Primers specifika för en eftertraktad gen sätts till en lösning som innehåller DNA, och ett DNA-polymeras tillsätts tillsammans med en blandning som innehåller molekyler som kommer att behövas (till exempel nukleotider och joner ). Om den relevanta genen är närvarande, fördubblas mängden målgen varje gång denna process körs. Efter denna process demonstreras närvaron av generna genom en mängd olika metoder, inklusive elektrofores , södra blotting och andra analysmetoder för DNA -sekvensering .

DNA -mikroarrayer och chips använder bindningen av komplementärt DNA till en målgen eller nukleinsyrasekvens. Fördelen med detta är att flera gener kan bedömas samtidigt.

MALDI-TOF

Matrisassisterad laser-desorptionjoniseringstid för flygmasspektrometri (MALDI-TOF MS) är en annan metod för känslighetstestning. Detta är en form av tid-för-flyg-masspektrometri , där molekylerna i en bakterie utsätts för matrisassisterad laserdesorption . De joniserade partiklarna accelereras sedan och spektrala toppar registreras, vilket ger en uttrycksprofil som kan differentiera specifika bakteriestammar efter att ha jämförts med kända profiler. Detta inkluderar, i samband med antibiotikakänslighetstestning, stammar såsom beta-laktamas som producerar E coli . MALDI-TOF är snabb och automatiserad. Det finns dock begränsningar för att testa i detta format; resultaten kanske inte matchar resultaten från fenotypiska tester, och förvärv och underhåll är dyrt.

Rapportering

Resultaten av testet rapporteras som en tabell, ibland kallad ett antibiogram. Bakterier är märkta som känsliga, resistenta eller med intermediär resistens mot ett antibiotikum baserat på den minsta hämmande koncentrationen (MIC), vilket är den lägsta koncentrationen av antibiotikumet som stoppar bakterietillväxten. MIC jämförs med standardtröskelvärden (kallade "brytpunkter") för en given bakterie och ett antibiotikum. Brytpunkter för samma organism och antibiotika kan skilja sig beroende på infektionsstället: till exempel definierar CLSI i allmänhet Streptococcus pneumoniae som känslig för intravenös penicillin om MIC är ≤0,06 μg/ml, mellanliggande om MIC är 0,12 till 1 μg/ml, och resistenta om MIC är ≥2 μg/ml, men för fall av meningit är brytpunkterna betydligt lägre. Ibland, om ett antibiotikum är märkt som resistent, är också baserat på bakteriella egenskaper som är associerade med kända resistensmetoder, såsom potentialen för beta-laktamasproduktion . Specifika mönster för läkemedelsresistens eller resistens mot flera läkemedel kan noteras, såsom närvaron av ett utvidgat spektrum beta-laktamas . Sådan information kan vara användbar för klinikern, som kan ändra den empiriska behandlingen till en skräddarsydd behandling som endast riktas mot den orsakande bakterien.

Klinisk praxis

Antibiotikaresistensprov : Bakterier strimmas på fat med vita skivor, var och en impregnerad med ett annat antibiotikum. Tydliga ringar, till exempel de till vänster, visar att bakterier inte har vuxit - vilket indikerar att dessa bakterier inte är resistenta. Bakterierna till höger är helt resistenta mot alla utom två av de sju testade antibiotika.

Idealisk antibiotikabehandling bygger på att bestämma orsaksmedlet och dess antibiotikakänslighet. Empirisk behandling startas ofta innan laboratoriemikrobiologiska rapporter finns tillgängliga. Detta kan vara för vanliga eller relativt mindre infektioner baserade på kliniska riktlinjer (t.ex. förvärvad lunginflammation ) eller för allvarliga infektioner, såsom sepsis eller bakteriell meningit , där fördröjd behandling medför stora risker. Effektiviteten av enskilda antibiotika varierar med infektionens anatomiska plats, antibiotikans förmåga att nå infektionsstället och bakteriernas förmåga att motstå eller inaktivera antibiotikumet.

Prover för antibiotikakänslighetstest samlas idealiskt in innan behandlingen påbörjas. Ett prov kan tas från platsen för en misstänkt infektion. såsom ett blododlingsprov när bakterier misstänks finnas i blodomloppet ( bakteriemi ), ett sputumprov vid lunginflammation eller urinprov vid urinvägsinfektion . Ibland kan flera prover tas om källan till en infektion inte är klar. Dessa prover överförs till mikrobiologilaboratoriet där de läggs till odlingsmedier , i eller på vilka bakterierna växer tills de finns i tillräckliga mängder för identifiering och känslighetstestning.

När testet av antibiotikakänslighet är slutfört kommer det att rapportera de organismer som finns i provet och vilka antibiotika de är mottagliga för. Även om antibiotikakänslighetstest görs i ett laboratorium ( in vitro ), är informationen om detta ofta kliniskt relevant för antibiotika hos en person ( in vivo ). Ibland måste ett beslut fattas för vissa bakterier om de är orsaken till en infektion, eller helt enkelt kommensala bakterier eller föroreningar, såsom Staphylococcus epidermidis och andra opportunistiska infektioner . Andra överväganden kan påverka valet av antibiotika, inklusive behovet av att tränga igenom till en infekterad plats (t.ex. en abscess ), eller misstanken att en eller flera orsaker till en infektion inte upptäcktes i ett prov.

Historia

Sedan upptäckten av beta-laktam antibiotikum penicillin har antimikrobiell resistens ökat. Med tiden har metoder för att testa bakteriers känslighet för antibiotika utvecklats och förändrats.

Alexander Fleming utvecklade på 1920 -talet den första metoden för känslighetstestning. "Rännmetoden" som han utvecklade var en diffusionsmetod, som involverade ett antibiotikum som diffunderade genom en ränna gjord av agar. På 1940 -talet använde flera utredare, inklusive påven, Foster och Woodruff, Vincent och Vincent, pappersskivor istället. Alla dessa metoder innebär att man bara testar känsligheten för penicillin. Resultaten var svåra att tolka och inte tillförlitliga på grund av felaktiga resultat som inte standardiserades mellan laboratorier.

Spädning har använts som en metod för att växa och identifiera bakterier sedan 1870 -talet, och som en metod för att testa bakteriers mottaglighet för antibiotika sedan 1929, också av Alexander Fleming. Sättet att bestämma mottaglighet förändrades från hur grumlig lösningen var, till pH (1942), till optiska instrument. Användningen av större rörbaserade "makrodilution" -tester har ersatts av mindre "mikrodilutering" -satser.

År 1966 bekräftade Världshälsoorganisationen Kirby-Bauer-metoden som standardmetod för känslighetstestning; det är enkelt, kostnadseffektivt och kan testa flera antibiotika.

Etest utvecklades 1980 av Bolmstrӧm och Eriksson, och MALDI-TOF utvecklades på 2000-talet. En rad automatiska system har utvecklats sedan och efter 1980 -talet. PCR var det första tillgängliga genetiska testet och publicerades först som en metod för att upptäcka antibiotikakänslighet 2001.

Vidare forskning

Point-of-care-test utvecklas för att påskynda tiden för testning och för att hjälpa utövare att undvika att förskriva onödiga antibiotika i stil med precisionsmedicin . Traditionella tekniker tar vanligtvis mellan 12 och 48 timmar, även om det kan ta upp till fem dagar. Däremot definieras snabba tester med molekylär diagnostik som "att vara möjliga inom ett 8-timmars (vårt) arbetsskifte". Framstegen har varit långsamma på grund av en rad olika orsaker, inklusive kostnad och reglering.

Ytterligare forskning är inriktad på bristerna i nuvarande testmetoder. Förutom hur lång tid det tar att rapportera fenotypiska metoder, är de mödosamma, har svåra portabilitet och är svåra att använda i resursbegränsade miljöer och har en chans till korskontaminering.

Från och med 2017, point-of-care resistens diagnostik var tillgängliga för meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), rifampin -resistenta Mycobacterium tuberculosis (TB), och vankomycin-resistenta enterokocker (VRE) genom Genexpert genom molekylär diagnostikfirma Cepheid .

Kvantitativ PCR, för att bestämma procentandelen av en detekterad bakterie som har en resistensgen, undersöks. Hela genomsekvensering av isolerade bakterier undersöks också och kommer troligen att bli mer tillgänglig när kostnaderna minskar och hastigheten ökar med tiden.

Ytterligare utforskade metoder inkluderar mikrofluidik , som använder en liten mängd vätska och en mängd olika testmetoder, såsom optisk, elektrokemisk och magnetisk. Sådana analyser kräver inte mycket vätska för att testas, är snabba och bärbara.

Användningen av fluorescerande färgämnen har undersökts. Dessa involverar märkta proteiner riktade mot biomarkörer , nukleinsyrasekvenser som finns i celler som finns när bakterien är resistent mot ett antibiotikum. Ett isolat av bakterier fixeras på plats och löses sedan upp. Isolatet exponeras sedan för fluorescerande färgämne, vilket kommer att vara självlysande när det ses.

Förbättringar av befintliga plattformar undersöks också, inklusive förbättringar i bildsystem som snabbare kan identifiera MIC i fenotypiska prover; eller användningen av bioluminescerande enzymer som avslöjar bakterietillväxt för att göra förändringar lättare synliga.

Bibliografi

Referenser

externa länkar

• Antibiogramteknikvideo (diffusionsmetod)