Cytogenetik - Cytogenetics

För den vetenskapliga tidskriften för denna titel, se Cytogenetic and Genome Research .
En metafascell positiv för BCR/ABL -omarrangemang med FISH

Cytogenetik är i huvudsak en gren av genetiken , men är också en del av cellbiologi/cytologi (en underavdelning av mänsklig anatomi), som handlar om hur kromosomerna förhåller sig till cellbeteende, särskilt deras beteende under mitos och meios . Tekniker som används inkluderar karyotypning , analys av G-bandade kromosomer, andra cytogenetiska bandningstekniker, liksom molekylär cytogenetik såsom fluorescerande in situ- hybridisering (FISH) och jämförande genomisk hybridisering (CGH).

Historia

Början

Kromosomer observerades först i växtceller av Karl Wilhelm von Nägeli 1842. Deras beteende i animaliska ( salamander ) celler beskrevs av Walther Flemming , upptäckaren av mitos , 1882. Namnet myntades av en annan tysk anatom, von Waldeyer 1888 .

Nästa steg ägde rum efter utvecklingen av genetik i början av 1900 -talet, då man insåg att uppsättningen kromosomer ( karyotypen ) var bäraren av generna. Levitsky verkar ha varit den första som definierade karyotypen som de somatiska kromosomernas fenotypiska utseende , till skillnad från deras geniska innehåll. Det tog många år att undersöka den mänskliga karyotypen för att lösa den mest grundläggande frågan: hur många kromosomer innehåller en normal diploid cell? År 1912 rapporterade Hans von Winiwarter 47 kromosomer i spermatogoni och 48 i oogonia , vilket avslutade en XX/XO könsbestämningsmekanism . Målaren 1922 var inte säker på om det diploida antalet människor var 46 eller 48, först gynnade 46. Han reviderade sin åsikt senare från 46 till 48, och han insisterade korrekt på att människor skulle ha ett XX/XY- system för könsbestämning. Med tanke på deras tekniker var dessa resultat ganska anmärkningsvärda. I vetenskapliga böcker förblev antalet mänskliga kromosomer på 48 i över trettio år. Nya tekniker behövdes för att rätta till detta fel. Joe Hin Tjio som arbetar i Albert Levans laboratorium var ansvarig för att hitta tillvägagångssättet:

  1. Använda celler i kultur
  2. Förbehandla celler i en hypotonisk lösning , som sväller dem och sprider kromosomerna
  3. Stoppar mitos i metafas med en lösning av kolchicin
  4. Kläm preparatet på bilden som tvingar kromosomerna till ett enda plan
  5. Klipp upp ett mikrofotografi och ordna resultatet till ett obestridligt karyogram.

Det tog fram till 1956 innan det allmänt accepterades att människans karyotyp endast innehöll 46 kromosomer. De stora aporna har 48 kromosomer. Mänsklig kromosom 2 bildades genom en sammanslagning av förfädernas kromosomer, vilket reducerade antalet.

Applikationer inom cytogenetik

McClintocks arbete med majs

Barbara McClintock började sin karriär som majs Cytogenetikern. År 1931 visade McClintock och Harriet Creighton att cytologisk rekombination av markerade kromosomer korrelerade med rekombination av genetiska egenskaper ( gener ). McClintock fortsatte vid Carnegie Institution tidigare studier om mekanismerna för kromosombrott och fusionsflare hos majs. Hon identifierade en särskild kromosombrott som alltid inträffade på samma plats på majskromosom 9, som hon kallade " Ds" eller "dissociation" locus. McClintock fortsatte sin karriär inom cytogenetik och studerade mekanik och arv av trasiga och ringformade (cirkulära) kromosomer av majs. Under sitt cytogenetiska arbete upptäckte McClintock transposoner , ett fynd som så småningom ledde till hennes Nobelpris 1983.

Naturliga populationer av Drosophila

På 1930 -talet samlade Dobzhansky och hans medarbetare Drosophila pseudoobscura och D. persimilis från vilda befolkningar i Kalifornien och grannstater. Med hjälp av målarens teknik studerade de polytenkromosomerna och upptäckte att de vilda populationerna var polymorfa för kromosomala inversioner . Alla flugor ser lika ut vilka inversioner de bär: detta är ett exempel på en kryptisk polymorfism.

Bevis samlades snabbt för att visa att naturligt urval var ansvarigt. Med hjälp av en metod som uppfanns av L'Héritier och Teissier uppfödde Dobzhansky populationer i befolkningsburar , vilket möjliggjorde utfodring, avel och provtagning samtidigt som flykt förhindrades. Detta hade fördelen av att eliminera migration som en möjlig förklaring till resultaten. Lager som innehåller inversioner vid en känd startfrekvens kan bibehållas under kontrollerade förhållanden. Det visade sig att de olika kromosomtyperna inte fluktuerar slumpmässigt, som om de skulle selektivt neutrala, utan anpassar sig till vissa frekvenser vid vilka de blir stabiliserade. När Dobzhansky publicerade den tredje upplagan av sin bok 1951 övertygades han om att kromosommorferna upprätthölls i befolkningen av heterozygoternas selektiva fördel, som med de flesta polymorfismer .

Lilja och mus

Liljan är en favoriserad organism för cytologisk undersökning av meios eftersom kromosomerna är stora och varje morfologiskt stadium av meios lätt kan identifieras mikroskopiskt. Hotta, Chandley et al. presenterade bevis för ett vanligt mönster av DNA -nickning och reparationssyntes i manliga meiotiska celler av liljor och gnagare under zygoten -pachytene -stadierna av meios när övergången antogs inträffa. Förekomsten av ett gemensamt mönster mellan organismer så fylogenetiskt avlägsna som lilja och mus fick författarna att dra slutsatsen att organisationen för meiotisk övergång i åtminstone högre eukaryoter förmodligen är universell i distributionen.

Mänskliga avvikelser och medicinska tillämpningar

Philadelphia -translokation t (9; 22) (q34; q11.2) ses vid kronisk myelogen leukemi.

Efter tillkomsten av förfaranden som möjliggjorde enkel uppräkning av kromosomer, gjordes snabbt upptäckter relaterade till avvikande kromosomer eller kromosomnummer. Vid vissa medfödda störningar, såsom Downs syndrom , avslöjade cytogenetik arten av den kromosomala defekten: en "enkel" trisomi. Avvikelser som härrör från icke -sammankopplade händelser kan orsaka celler med aneuploidi (tillägg eller raderingar av hela kromosomer) hos en av föräldrarna eller hos fostret. 1959 upptäckte Lejeune att patienter med Downs syndrom hade en extra kopia av kromosom 21. Downs syndrom kallas också trisomi 21.

Andra numeriska avvikelser som upptäcks inkluderar könskromosomavvikelser. En hona med bara en X -kromosom har Turners syndrom , medan ytterligare en X -kromosom hos en hane, vilket resulterar i totalt 47 kromosomer, har Klinefelters syndrom . Många andra könskromosomkombinationer är kompatibla med levande födda inklusive XXX, XYY och XXXX. Däggdjurs förmåga att tolerera aneuploidier i könskromosomerna härrör från förmågan att inaktivera dem , vilket krävs hos normala honor för att kompensera för att ha två kopior av kromosomen. Alla gener på X -kromosomen är inte inaktiverade, varför det finns en fenotypisk effekt hos individer med extra X -kromosomer.

Trisomi 13 associerades med Pataus syndrom och trisomi 18 med Edwards syndrom .

År 1960 upptäckte Peter Nowell och David Hungerford en liten kromosom i de vita blodkropparna hos patienter med kronisk myelogen leukemi (CML). Denna onormala kromosom kallades Philadelphia -kromosomen - eftersom båda forskarna forskade i Philadelphia, Pennsylvania . Tretton år senare, med utvecklingen av mer avancerade tekniker, visades den onormala kromosomen av Janet Rowley som ett resultat av en translokation av kromosomer 9 och 22. Identifiering av Philadelphia -kromosomen genom cytogenetik är diagnostisk för CML.

Tillkomsten av bandningstekniker

Mänsklig manlig karyotyp.

I slutet av 1960-talet utvecklade Torbjörn Caspersson en kinakrin fluorescerande färgningsteknik (Q-banding) som avslöjade unika bandmönster för varje kromosompar. Detta gjorde att kromosompar av annars lika stor storlek kunde differentieras genom distinkta horisontella bandmönster. Bandningsmönster används nu för att belysa brytpunkterna och de kromosomer som ingår i kromosomtranslokationer . Raderingar och inversioner inom en enskild kromosom kan också identifieras och beskrivas mer exakt med hjälp av standardiserad bandningsnomenklatur. G-banding (med trypsin och Giemsa/ Wright-färgning) utvecklades samtidigt i början av 1970-talet och möjliggör visualisering av bandmönster med hjälp av ett ljusfältmikroskop.

Diagram som identifierar kromosomerna baserat på bandmönstren kallas idiogram . Dessa kartor blev grunden för både prenatala och onkologiska fält för att snabbt flytta cytogenetik till det kliniska laboratoriet där karyotypning tillät forskare att leta efter kromosomförändringar. Teknikerna utökades för att möjliggöra odling av fria fostervatten som utvinns från fostervatten och förlängningstekniker för alla kulturtyper som möjliggör bandning med högre upplösning.

Början på molekylär cytogenetik

På 1980 -talet gjordes framsteg inom molekylär cytogenetik . Medan radioisotopmärkta prober hade hybridiserats med DNA sedan 1969, gjordes nu rörelse med användning av fluorescerande märkta prober. Hybridisering av dem till kromosomala preparat med hjälp av befintliga tekniker blev känd som fluorescens in situ -hybridisering (FISH). Denna förändring ökade avsevärt användningen av sonderingstekniker eftersom fluorescerande märkta prober är säkrare. Ytterligare framsteg inom mikromanipulering och undersökning av kromosomer ledde till tekniken för kromosom mikrodissektion varigenom avvikelser i kromosomstruktur kunde isoleras, klonas och studeras i allt större detalj.

Tekniker

Karyotypning

Rutinen kromosomanalys ( karyotypning ) avser analys av metafas- kromosomer som har bandade med användning av trypsin följt av Giemsa , Leishmanns, eller en blandning av de två. Detta skapar unika bandmönster på kromosomerna. Den molekylära mekanismen och orsaken till dessa mönster är okända, även om det sannolikt relaterade till replikeringstidpunkt och kromatinpackning.

Flera kromosombandande tekniker används i cytogenetiska laboratorier. Kinakrinbandning (Q-banding) var den första färgningsmetoden som användes för att producera specifika bandmönster. Denna metod kräver ett fluorescensmikroskop och används inte längre lika ofta som Giemsa- bandning (G-banding). Omvänd bandning, eller R-banding, kräver värmebehandling och vänder det vanliga svartvita mönstret som syns i G-band och Q-band. Denna metod är särskilt användbar för färgning av kromosomernas distala ändar. Andra färgningstekniker inkluderar C-banding och nukleolära organiserande regionfläckar (NOR-fläckar). Dessa senare metoder färgar specifikt vissa delar av kromosomen. C-bandning fläckar det konstitutiva heterokromatinet , som vanligtvis ligger nära centromeren, och NOR-färgning markerar satelliterna och stjälkarna av akrocentriska kromosomer .

Högupplöst bandning innefattar färgning av kromosomer under profas eller tidig metafas (prometafas), innan de når maximal kondens. Eftersom profas- och prometafas -kromosomer är mer utsträckta än metafaskromosomer, ökar antalet band som kan observeras för alla kromosomer från cirka 300 till 450 till så många som 800. Detta gör det möjligt att upptäcka mindre uppenbara abnormiteter som vanligtvis inte ses med konventionell bandning.

Bildförberedelse

Celler från benmärg , blod, fostervatten, navelsträngsblod , tumör och vävnader (inklusive hud, navelsträng , korionisk villi, lever och många andra organ) kan odlas med hjälp av standard cellodlingstekniker för att öka antalet. En mitotisk hämmare ( kolkicin , kolcemid ) tillsätts sedan till kulturen. Detta stoppar celldelning vid mitos vilket möjliggör ett ökat utbyte av mitotiska celler för analys. Cellerna centrifugeras och media och mitotisk hämmare avlägsnas och ersätts med en hypotonisk lösning. Detta gör att de vita blodkropparna eller fibroblasterna sväller så att kromosomerna kommer att spridas när de läggs till ett objektglas samt lyserar de röda blodkropparna. Efter att cellerna fått sitta i hypotonisk lösning tillsätts Carnoys fixeringsmedel (3: 1 metanol till isättika ). Detta dödar cellerna och härdar kärnorna i de återstående vita blodkropparna. Cellerna fixeras i allmänhet upprepade gånger för att ta bort skräp eller kvarvarande röda blodkroppar. Cellsuspensionen tappas sedan på objektglas. Efter att ha lagrat bilderna i en ugn eller väntat några dagar är de redo för bandning och analys.

Analys

Analys av bandade kromosomer görs i ett mikroskop av en klinisk laboratoriespecialist i cytogenetik (CLSp (CG)). Generellt analyseras 20 celler vilket är tillräckligt för att utesluta mosaicism till en acceptabel nivå. Resultaten sammanfattas och ges till en styrelsecertifierad cytogenetiker för granskning och för att skriva en tolkning med hänsyn till patientens tidigare historia och andra kliniska fynd. Resultaten lämnas sedan ut rapporterade i ett International System for Human Cytogenetic Nomenclature 2009 (ISCN2009).

Fluorescerande in situ -hybridisering

Interfasceller positiva för vid (9; 22) omarrangemang

Fluorescerande in situ -hybridisering (FISH) avser användning av fluorescensmärkt sond för att hybridisera till cytogenetiska cellpreparat.

Förutom standardberedningar kan FISH också utföras på:

Bildförberedelse

Detta avsnitt avser beredning av standard cytogenetiska preparat

Objektglaset åldras med en saltlösning som vanligtvis består av 2X SSC (salt, natriumcitrat). Objektglasen dehydratiseras sedan i etanol och sondblandningen tillsätts. Prov- DNA: t och sond-DNA samenatureras sedan med användning av en uppvärmd platta och får återglödgas i minst 4 timmar. Objektglasen tvättas sedan för att avlägsna överskottet av obunden sond och motfärgas med 4 ', 6-Diamidino-2-fenylindol ( DAPI ) eller propidiumjodid.

Analys

Analys av FISH -prover görs genom fluorescensmikroskopi av en klinisk laboratoriespecialist i cytogenetik. För onkologi görs i allmänhet ett stort antal interfasceller för att utesluta lågnivåresidens, vanligtvis mellan 200 och 1000 celler räknas och poängsätts. För medfödda problem görs vanligtvis 20 metafasceller.

Framtiden för cytogenetik

Framstegen fokuserar nu på molekylär cytogenetik inklusive automatiserade system för att räkna resultaten av standard FISH -preparat och tekniker för virtuell karyotypning , såsom jämförande genomiska hybridiseringsarrayer, CGH och Single nucleotide polymorphism arrays.

Se även

Referenser

externa länkar