Optogenetik - Optogenetics
Optogenetik är en biologisk teknik som innebär användning av ljus för att styra neuroner som har modifierats genetiskt för att uttrycka ljuskänsliga jonkanaler . Som sådan är optogenetik en neuromoduleringsmetod som använder en kombination av tekniker från optik och genetik för att kontrollera enskilda neurons aktiviteter i levande vävnad- även inom fritt rörliga djur. I vissa användningsområden hänvisar optogenetik också till optisk övervakning av neuronal aktivitet eller kontroll av andra biokemiska vägar i icke-neuronala celler (se avsnittet "Cellbiologi/cellsignalvägar" nedan), även om dessa forskningsaktiviteter föregick användningen av ljuskänslig jon kanaler i neuroner. Eftersom optogenetik används av vissa författare för att endast hänvisa till optisk kontroll av aktiviteten hos genetiskt definierade neuroner och inte dessa ytterligare forskningsmetoder, är termen optogenetik ett exempel på polysemi .
Neuronal kontroll uppnås med optogenetiska ställdon som channelrhodopsin , halorhodopsin och archaerhodopsin , medan optisk registrering av neuronala aktiviteter kan göras med hjälp av optogenetiska sensorer för kalcium ( GCaMP ), vesikulär frisättning ( synapto-pHluorin ), signalsubstanser ( GluSnFRs ) eller membranspänning (kvasarer, accelerationssensor för åtgärdspotentialer, Archons). Kontroll (eller registrering) av aktivitet är begränsad till genetiskt definierade neuroner och utförs på ett spatiotemporalt specifikt sätt med ljus.
Under 2010 valdes optogenetik som "Årets metod" inom alla vetenskaps- och teknikområden av den tvärvetenskapliga forskningstidskriften Nature Methods . Samtidigt belystes optogenetik i artikeln om "Decenniums genombrott" i den akademiska forskningstidskriften Science .
Historia
År 1979 föreslog Francis Crick att kontrollera alla celler från en typ i hjärnan medan de andra mer eller mindre oförändrade är en verklig utmaning för neurovetenskapen. Francis Crick spekulerade i att en teknik som använder ljus kan vara användbar för att kontrollera neuronal aktivitet med tidsmässig och rumslig precision men vid den tiden fanns det ingen teknik för att få neuroner att reagera på ljus.
I början av 1990 -talet hade LC Katz och E Callaway visat att ljuset kunde ta bort glutamat. Heberle och Büldt 1994 hade redan visat funktionellt heterologt uttryck av ett bakteriorhodopsin för ljusaktiverat jonflöde i jäst. Senare 1995, Georg Nagel et al. och Ernst Bamberg provade det heterologa uttrycket av mikrobiella rhodopsiner (även bakteriorhodopsin och även i ett icke-neuralt system, Xenopus-oocyter) (Nagel et al., 1995, FEBS Lett.) och visade ljusinducerad ström.
En tidigare användning av ljus för att aktivera neuroner utfördes av Richard Fork , som demonstrerade laseraktivering av neuroner i intakt vävnad, men inte på ett genetiskt riktat sätt. Den tidigaste genetiskt riktade metoden som använde ljus för att kontrollera rhodopsinsensibiliserade neuroner rapporterades i januari 2002 av Boris Zemelman och Gero Miesenböck , som använde Drosophila rhodopsin- odlade däggdjursneuroner. År 2003 utvecklade Zemelman och Miesenböck en andra metod för ljusberoende aktivering av neuroner där enstaka jonotropa kanaler TRPV1, TRPM8 och P2X2 grindades av fotocagerade ligander som svar på ljus. Från och med 2004 utvecklade Kramer- och Isacoff -grupperna organiska fotoswitchar eller "reversibelt burade" föreningar i samarbete med Traunergruppen som kunde interagera med genetiskt införda jonkanaler. TRPV1 -metodik, om än utan belysningstrigger, användes därefter av flera laboratorier för att ändra utfodring, rörelse och beteendemässig motståndskraft hos försöksdjur. Emellertid tillämpades inte ljusbaserade tillvägagångssätt för att förändra neuronal aktivitet utanför de ursprungliga laboratorierna, troligen eftersom det lättare att använda channelrhodopsin klonades strax därefter.
Peter Hegemann , som studerade ljusresponsen från gröna alger vid University of Regensburg, hade upptäckt fotoströmmar som var för snabba för att förklaras av de klassiska g-proteinkopplade djur-rhodopsinerna . Tillsammans med elektrofysiologen Georg Nagel vid Max Planck Institute i Frankfurt kunde de visa att en enda gen från algen Chlamydomonas producerade stora fotoströmmar när de uttrycks i en grodas oocyt. För att identifiera uttrycksceller ersatte de den cytoplasmatiska svansen av algproteinet med ett fluorescerande protein YFP , vilket genererade det första allmänt tillämpbara optogenetiska verktyget. De uppgav i 2003 -dokumentet att "uttryck av ChR2 i oocyter eller däggdjursceller kan användas som ett kraftfullt verktyg för att öka cytoplasmatisk Ca 2+ -koncentration eller för att depolarisera cellmembranet, helt enkelt genom belysning".
Karl Deisseroth vid Bioengineering Department i Stanford publicerade anteckningsboksidorna från början av juli 2004 i sitt första experiment som visar ljusaktivering av neuroner som uttrycker ett kanalrhodopsin. I augusti 2005 publicerade hans laboratoriepersonal, inklusive doktorander Ed Boyden och Feng Zhang , i samarbete med Georg Nagel den första demonstrationen av ett enkomponents optogenetiskt system, i neuroner med hjälp av channelrhodopsin-2 (H134R) -eYFP-konstruktionen från Nagel och Hegemann.
Zhuo-Hua Pan från Wayne State University , forskade på att återställa synen till blindhet, försökte kanalrhodopsin ut i ganglionceller-neuronerna i våra ögon som ansluter direkt till hjärnan. Pans första observation av optisk aktivering av retinala neuroner med channelrhodopsin var i augusti 2004 enligt Pan, en månad efter Deisseroths första observation. Faktum är att de transfekterade nervcellerna blev elektriskt aktiva som svar på ljus, och 2005 rapporterade Zhuo-Hua Pan framgångsrik in-vivo-transfektion av channelrhodopsin i retinala ganglionceller hos möss och elektriska svar på fotostimulering i retinalskivodling.
I april 2005 rapporterade Susana Lima och Miesenböck den första användningen av genetiskt riktad P2X2 fotostimulering för att kontrollera ett djurs beteende. De visade att fotostimulering av genetiskt begränsade grupper av neuroner, såsom de i det dopaminerga systemet, framkallade karakteristiska beteendeförändringar hos fruktflugor.
I oktober 2005 publicerade Lynn Landmesser och Stefan Herlitze också användningen av channelrohodpsin-2 för att kontrollera neuronal aktivitet i odlade hippocampusneuroner och kycklingryggmärgskretsar i intakta utvecklande embryon. Dessutom introducerade de för första gången ryggradsdjur rhodopsin, en ljusaktiverad G-proteinkopplad receptor, som ett verktyg för att hämma neuronal aktivitet via rekrytering av intracellulära signalvägar också i hippocampus neuroner och det intakta utvecklande kycklingembryot.
Grupperna av Alexander Gottschalk och Georg Nagel gjorde den första ChR2-mutanten (H134R) och använde först channelrhodopsin-2 för att kontrollera neuronal aktivitet hos ett intakt djur, vilket visar att motoriska mönster i rundmask C. elegans kunde framkallas genom ljusstimulering av genetiskt utvalda neurala kretsar (publicerad i december 2005). Hos möss uppnås ofta kontrollerat uttryck för optogenetiska verktyg med celltypspecifika Cre/loxP-metoder som utvecklats för neurovetenskap av Joe Z. Tsien på 1990-talet för att aktivera eller hämma specifika hjärnregioner och celltyper in vivo .
År 2007 rapporterade laboratorierna för Boyden och Deisseroth (tillsammans med grupperna Gottschalk och Nagel) samtidigt framgångsrik optogenetisk hämning av aktivitet i neuroner.
2007 startade Nagel och Hegemanns grupper den optogenetiska manipulationen av cAMP. 2014, Avelar et al. rapporterade den första rhodopsin-guanylyl-cyklasgenen från svamp. 2015, Scheib et al. och Gao et al. kännetecknade aktiviteten hos rhodopsin-guanylylcyklasgenen. Och Shiqiang Gao et al. och Georg Nagel, Alexander Gottschalk identifierade det som det första 8 TM enzymet rhodopsin.
Innan utvecklingen av optogentiska ställdon utvecklades optogenetiska aktivitetssensorer, till exempel genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI). Den första GECI som användes för bildaktivitet hos ett djur var kameleon , designad av Atsushi Miyawaki, Roger Tsien och medarbetare 1997. Cameleon användes först framgångsrikt i ett djur av Rex Kerr, William Schafer och kollegor för att spela in från neuroner och muskelceller av nematoden C. elegans . Kameleon användes därefter för att registrera neural aktivitet hos flugor och zebrafiskar. Hos däggdjur, det första GECI användas in vivo var GCaMP , utvecklades först av Nakai och medarbetare. GCaMP har genomgått många förbättringar, och GCaMP6 i synnerhet har blivit allmänt använd inom neurovetenskap.
Utmärkelser
Den kraftfulla effekten av optogenetisk teknik på hjärnforskning har erkänts av många utmärkelser till nyckelspelare inom området.
År 2010 tilldelades Georg Nagel, Peter Hegemann och Ernst Bamberg Wiley -priset i biomedicinsk vetenskap och de var också bland dem som tilldelades Karl Heinz Beckurts -priset 2010. Samma år tilldelades Karl Deisseroth det inledande HFSP Nakasone -priset för " hans banbrytande arbete med utveckling av optogenetiska metoder för att studera funktionen hos neuronala nätverk som ligger till grund för beteende ".
2012 tilldelades Bamberg, Deisseroth, Hegemann och Nagel Zülch -priset av Max Planck Society , och Miesenböck tilldelades Baillet Latour hälsopriset för att "ha varit föregångare inom optogenetiska metoder för att manipulera neuronal aktivitet och kontrollera djurens beteende."
2013 var Nagel och Hegemann bland dem som tilldelades Louis-Jeantet-priset för medicin . Även det året, år, tilldelades Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck och Nagel tillsammans The Brain Prize för "deras uppfinning och förfining av optogenetik."
År 2017 tilldelades Deisseroth Else Kröner Fresenius forskningspris för "sina upptäckter inom optogenetik och hydrogel-vävnadskemi, samt sin forskning om depressionens neurologiska kretslopp."
År 2018 överlämnade Inamori -stiftelsen till Deisseroth Kyoto -priset för "ledande optogenetik" och "revolutionerande system neurovetenskaplig forskning".
År 2019 tilldelades Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck och Nagel Rumford -priset av American Academy of Arts and Sciences som ett erkännande av "deras extraordinära bidrag relaterade till uppfinningen och förfining av optogenetik."
År 2020 tilldelades Deisseroth Heineken-priset för medicin från Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences , för att utveckla optogenetik och hydrogel-vävnadskemi. Samma år fick Miesenböck, Hegemann och Nagel gemensamt Shaw -priset i biovetenskap och medicin.
Beskrivning
Optogenetics ger tidsmässig precision i millisekundskala som gör det möjligt för experimenteraren att hålla jämna steg med snabb biologisk informationsbehandling (till exempel genom att undersöka kausalrollen hos specifika åtgärdspotentialmönster i definierade neuroner). För att undersöka den neurala koden måste optogenetik per definition fungera på millisekundernas tidsskala för att tillåta tillägg eller radering av exakta aktivitetsmönster inom specifika celler i hjärnan hos intakta djur, inklusive däggdjur (se figur 1) . Som jämförelse är den tidsmässiga precisionen hos traditionella genetiska manipulationer (används för att undersöka kausala roll hos specifika gener i celler, via "funktionsförlust" eller "funktionsförstärkning" -förändringar i dessa gener) ganska långsam, från timmar eller dagar till månader. Det är viktigt att också ha snabba avläsningar inom optogenetik som kan hålla jämna steg med den optiska kontrollen. Detta kan göras med elektriska inspelningar ("optroder") eller med reporterproteiner som är biosensorer , där forskare har smält fluorescerande proteiner till detektorproteiner. Ett exempel på detta är spänningskänsligt fluorescerande protein (VSFP2). Dessutom, utöver dess vetenskapliga inverkan, representerar optogenetik en viktig fallstudie av värdet av både ekologisk bevarande (eftersom många av de viktigaste verktygen för optogenetik härrör från mikrobiella organismer som upptar specialiserade miljönischer) och i betydelsen av ren grundvetenskap som dessa opsins var studerat under decennier för deras egen skull av biofysiker och mikrobiologer, utan att behöva ta hänsyn till deras potentiella värde för att ge insikter om neurovetenskap och neuropsykiatrisk sjukdom.
Ljusaktiverade proteiner: kanaler, pumpar och enzymer
Optogenetikens kännetecken är därför introduktion av snabba ljusaktiverade kanaler, pumpar och enzymer som möjliggör tidsmässigt exakt manipulation av elektriska och biokemiska händelser samtidigt som upprätthållande av celltyp upprätthålls genom användning av specifika inriktningsmekanismer. Bland de mikrobiella opsins som kan användas för att undersöka funktionen hos neurala system finns kanalrhodopsiner (ChR2, ChR1, VChR1 och SFO) för att excitera neuroner och anjonledande kanalrhodopsiner för ljusinducerad hämning. Indirekt ljuskontrollerade kaliumkanaler har nyligen konstruerats för att förhindra att potentiell potentiell generation genereras i neuroner under blått ljus. Ljusdrivna jonpumpar används också för att hämma neuronal aktivitet, t.ex. halorhodopsin (NpHR), förbättrade halorhodopsiner (eNpHR2.0 och eNpHR3.0, se figur 2), archaerhodopsin (Arch), svampopsins (Mac) och förbättrad bacteriorhodopsin (eBR) ).
Optogenetisk kontroll av väldefinierade biokemiska händelser hos beteende däggdjur är nu också möjlig. Genom att bygga på tidigare arbete som fusionerar ryggradsdjur opsins till specifika G-proteinkopplade receptorer skapades en familj av chimära enkomponentoptogenetiska verktyg som gjorde det möjligt för forskare att manipulera inom beteende däggdjur koncentrationen av definierade intracellulära budbärare som cAMP och IP3 i riktade celler. Andra biokemiska tillvägagångssätt för optogenetik (avgörande med verktyg som visade låg aktivitet i mörkret) följde snart därefter, då optisk kontroll över små GTPaser och adenylylcyklas uppnåddes i odlade celler med nya strategier från flera olika laboratorier. Fotoaktiverade adenylylcykler har upptäckts i svampar och framgångsrikt använts för att kontrollera cAMP -nivåer i däggdjursneuroner. Denna framväxande repertoar av optogenetiska ställdon tillåter nu celltypspecifik och tidsmässigt exakt kontroll av flera axlar av cellulär funktion inom intakta djur.
Hårdvara för lätt applikation
En annan nödvändig faktor är hårdvara (t.ex. integrerade fiberoptiska och fasta ljuskällor) för att möjliggöra att specifika celltyper, även djupt inne i hjärnan, kan kontrolleras i fritt uppförande djur. Vanligtvis uppnås det senare med hjälp av fiberoptisk kopplad diodteknologi som introducerades 2007, men för att undvika användning av implanterade elektroder har forskare konstruerat sätt att skriva in ett "fönster" av zirkoniumoxid som har modifierats för att vara transparent och implanterat i mössskallar, för att låta optiska vågor tränga djupare in för att stimulera eller hämma enskilda neuroner. För att stimulera ytliga hjärnområden som hjärnbarken kan optiska fibrer eller lysdioder monteras direkt på djurets skalle. Mer djupt implanterade optiska fibrer har använts för att leverera ljus till djupare hjärnområden. Kompletterande till fiberkopplade metoder har helt trådlösa tekniker utvecklats med trådlös strömförsörjning till lysande LED-lampor för obehindrad studie av komplexa beteenden hos fritt uppförande organismer. De senaste framstegen undersöker användningen av organiska lysdioder (OLED) som stimuli för optogenetik. Den exakta och kontrollerade stimuleringen av neuroner som uttrycker mikrobiell opsin har demonstrerats in vitro på en tidsskala i storleksordningen millisekund. Pulserande drift möjliggör neural stimulering inom kompatibel låg temperatur. Dessutom är organiska ljusemitterande dioder (OLED) lämpliga för implantation i hjärnan för sin mycket tunna tjocklek som kan vara mindre än 1 µm.
Uttryck av optogenetiska ställdon
Optogenetik inkluderar också nödvändigtvis utveckling av genetiska inriktningsstrategier som cellspecifika promotorer eller andra anpassade villkorligt aktiva virus, för att leverera de ljuskänsliga sonderna till specifika populationer av neuroner i hjärnan hos levande djur (t.ex. maskar, fruktflugor, möss , råttor och apor). Hos ryggradslösa djur som maskar och fruktflugor kompletteras en viss mängd all-trans-retinal (ATR) med mat. En viktig fördel med mikrobiella opsins enligt ovan är att de är fullt fungerande utan tillsats av exogena ko-faktorer hos ryggradsdjur.
Metod
Tekniken för att använda optogenetik är flexibel och anpassningsbar efter experimentatorns behov. Till att börja med, experimenterar genetiskt en mikrobiell opsin baserad på grindegenskaperna (excitabilitet, eldfasthet etc.) som krävs för experimentet.
Det finns en utmaning att introducera det mikrobiella opsinet, ett optogenetiskt ställdon, i ett specifikt område av organismen i fråga. Ett rudimentärt tillvägagångssätt är att införa en konstruerad viral vektor som innehåller den optogenetiska aktuatorgenen bunden till en igenkännlig promotor såsom CAMKIIa . Detta möjliggör en viss grad av specificitet eftersom celler som redan innehåller och kan översätta den givna promotorn kommer att infekteras med virusvektorn och förhoppningsvis uttrycka den optogenetiska aktuatorgenen.
Ett annat tillvägagångssätt är skapandet av transgena möss där den optogenetiska aktuatorgenen introduceras i zygoter hos möss med en given promotor, oftast Thy1 . Introduktion av det optogenetiska ställdonet på ett tidigt stadium gör det möjligt att införliva en större genetisk kod och som ett resultat ökar specificiteten hos celler som ska infekteras.
Ett tredje och ganska nytt tillvägagångssätt som har utvecklats är att skapa transgena möss med Cre-rekombinas , ett enzym som katalyserar rekombination mellan två lox-P-platser. Genom att sedan införa en konstruerad viral vektor innehållande den optogenetiska aktuatorgenen mellan två lox-P-ställen kommer endast cellerna som innehåller Cre-rekombinas att uttrycka det mikrobiella opsinet. Denna sista teknik har gjort det möjligt att använda flera modifierade optogenetiska ställdon utan att behöva skapa en hel rad transgena djur varje gång en ny mikrobiell opsin behövs.
Efter introduktionen och uttrycket av den mikrobiella opsinen, beroende på vilken typ av analys som utförs, kan applicering av ljus placeras vid terminaländarna eller huvudområdet där de infekterade cellerna är belägna. Ljus stimulering kan utföras med ett brett spektrum av instrument från lysdioder (LED) eller diod-pumpad fastatillståndslaser (DPSS). Dessa ljuskällor är oftast anslutna till en dator via en fiberoptisk kabel. De senaste framstegen inkluderar tillkomsten av trådlösa huvudmonterade enheter som också applicerar LED på riktade områden och som ett resultat ger djuret större rörelsefrihet att reproducera in vivo- resultat.
Dessutom kan fiberbaserade tillvägagångssätt nu erbjuda samtidig encellsupplöst optisk stimulering och kalciumavbildning . Detta gör det möjligt för forskare att visualisera och manipulera aktiviteten hos enstaka neuroner samtidigt som naturligt djurbeteende bevaras. Vidare tillåter dessa tekniker att spela in i flera djupa hjärnregioner samtidigt med GRIN -linser anslutna via optisk fiber till en externt placerad fotodetektor och fotostimulator.
Frågor
Även om det redan är ett kraftfullt vetenskapligt verktyg, bör optogenetik, enligt Doug Tischer & Orion D. Weiner från University of California San Francisco , betraktas som en "första generationens GFP " på grund av dess enorma potential för både utnyttjande och optimering. Med det sagt begränsas det nuvarande tillvägagångssättet för optogenetik främst av dess mångsidighet. Även inom neurovetenskapens område där den är mest potent är tekniken mindre robust på subcellulär nivå. Ytterligare frågor tas upp av det rumsliga svaret på nivån av neurala nätverk.
Selektivt uttryck
Ett av optogenetikens huvudproblem är att inte alla celler i fråga kan uttrycka den mikrobiella opsingenen på samma nivå. Således kommer även belysning med en definierad ljusintensitet att ha varierande effekter på enskilda celler. Optogenetisk stimulering av neuroner i hjärnan styrs ännu mindre då ljusintensiteten sjunker exponentiellt från ljuskällan (t.ex. implanterad optisk fiber).
Dessutom visar matematisk modellering att selektivt uttryck av opsin i specifika celltyper dramatiskt kan förändra det neurologiska kretsarnas dynamiska beteende. I synnerhet kan optogenetisk stimulering som företrädesvis riktar sig mot hämmande celler transformera nervvävnadens excitabilitet från typ 1 - där neuroner fungerar som integratorer - till typ 2 där neuroner fungerar som resonatorer.
Typ 1 exciterbara medier upprätthåller förökande vågor av aktivitet medan typ 2 exciterande media inte gör det. Transformationen från den ena till den andra förklarar hur konstant optisk stimulering av primatmotoriska cortex framkallar gamma-band (40–80 Hz) svängningar på sätt som ett typ 2-exciterbart medium. Ändå förökar sig samma oscillationer långt in i den omgivande vävnaden på sätt som ett exciterbart medium av typ 1.
Det är fortfarande svårt att rikta opsin mot definierade subcellulära fack, t.ex. plasmamembranet, synaptiska vesiklar eller mitokondrier. Att begränsa opsinet till specifika regioner i plasmamembranet, såsom dendriter , somata eller axonterminaler, skulle ge en mer robust förståelse av neuronala kretsar.
Kinetik och synkronisering
Ett problem med channelrhodopsin-2 är att dess gatingegenskaper inte efterliknar in vivo katjonkanaler för kortikala neuroner. En lösning på detta problem med ett proteins kinetiska egenskap är introduktion av varianter av channelrhodopsin-2 med gynnsammare kinetik. [55] [56]
En annan av teknikens begränsningar är att ljusstimulering ger en synkron aktivering av infekterade celler och detta tar bort eventuella individuella cellegenskaper för aktivering bland den drabbade befolkningen. Därför är det svårt att förstå hur cellerna i befolkningen som påverkas kommunicerar med varandra eller hur deras fasiska egenskaper för aktivering kan relatera till kretsen som observeras.
Optogenetisk aktivering har kombinerats med funktionell magnetisk resonansavbildning (ofMRI) för att belysa kopplingen , en grundlig karta över hjärnans neurala anslutningar. Resultaten begränsas dock av de allmänna egenskaperna hos fMRI . Avläsningarna från detta neuroimaging-förfarande saknar den rumsliga och tidsmässiga upplösningen som är lämplig för att studera de tätt packade och snabbt avfyrande neuronala kretsarna.
Ljusabsorptionsspektrum
De opsinproteiner som för närvarande används har absorptionstoppar över det visuella spektrumet, men förblir avsevärt känsliga för blått ljus. Denna spektrala överlappning gör det mycket svårt att kombinera opsinaktivering med genetiskt kodade indikatorer ( GEVIs , GECIs , GluSnFR , synapto-pHluorin ), varav de flesta kräver blåsexcitation. Opsiner med infraröd aktivering skulle med ett standardbestrålningsvärde öka ljusgenomträngning och öka upplösningen genom minskning av ljusspridning.
Ytterligare data indikerar att absorptionsspektra för organiska färgämnen och fluorescerande proteiner, som används i optogenetiska tillämpningar, sträcker sig från cirka 250 nm till cirka 600 nm. Särskilda organiska föreningar som används i diskreta delar av detta område inkluderar: retinaler, flaviner, folater, p-kumarsyror, fytokrom kromofoter, kobalaminer och minst sex fluorescerande proteiner inklusive mOrange och mCherry.
Rumsligt svar
Att använda en smal gaussisk ljusstråle för att stimulera neuroner i en lapp av neural vävnad kan framkalla en svarsprofil som är mycket bredare än stimuleringsprofilen. I detta fall kan neuroner aktiveras (eller hämmas) oavsiktligt. Det finns beräkningssimuleringsverktyg som kan hjälpa till att motverka detta genom att uppskatta effekten av optogenetisk stimulering innan experiment utförs.
Ansökningar
Optogenetikens område har främjat den grundläggande vetenskapliga förståelsen för hur specifika celltyper bidrar till funktionen av biologiska vävnader, såsom neurala kretsar in vivo (se referenser från den vetenskapliga litteraturen nedan). På den kliniska sidan har dessutom optogenetikdriven forskning lett till insikter om Parkinsons sjukdom och andra neurologiska och psykiatriska störningar. Optogenetikpapper under 2009 har faktiskt också gett insikt i neurala koder som är relevanta för autism , schizofreni , drogmissbruk , ångest och depression . Optogenetik har också använts i en experimentell behandling för blindhet genom vilken ett protein som produceras på grund av genredigering stimuleras med ljus av konstruerade glasögon.
Identifiering av särskilda neuroner och nätverk
Amygdala
Optogenetiska metoder har använts för att kartlägga neurala kretsar i amygdala som bidrar till rädsla konditionering . Ett sådant exempel på en neural krets är kopplingen från den basolaterala amygdala till den dorsal-mediala prefrontala cortex där neuronala svängningar på 4 Hz har observerats i samband med rädsla inducerade frysbeteenden hos möss. Transgena möss introducerades med channelrhodoposin-2 fäst med en parvalbumin- Cre-promotor som selektivt infekterade interneuroner lokaliserade både i den basolaterala amygdala och dorsal-medial prefrontal cortex som var ansvarig för 4 Hz-svängningarna. Interneuronerna stimulerades optiskt för att generera ett frysbeteende och som ett resultat gav det bevis på att dessa 4 Hz-svängningar kan vara ansvariga för det grundläggande rädslarsvaret som produceras av neuronpopulationerna längs dorsal-medial prefrontal cortex och basolateral amygdala.
Luktlampa
Optogenetisk aktivering av luktsensoriska neuroner var avgörande för att demonstrera timing vid luktbearbetning och för mekanismen för neuromodulerande medierade luktstyrda beteenden (t.ex. aggression , parning ) Dessutom har bevis med hjälp av optogenetik reproducerats för att visa att "efterbilden" av lukt koncentreras mer centralt kring luktlampan snarare än i periferin där luktreceptorn neuroner skulle vara belägna. Transgena möss infekterade med kanal-rhodopsin Thy1-ChR2 stimulerades med en 473 nm laser transcraniellt placerad över dorsalsektionen av luktlampan. Längre fotostimulering av mitralceller i luktlampan ledde till observationer av längre varaktig neuronal aktivitet i regionen efter att fotostimuleringen hade upphört, vilket innebär att det luktande sensoriska systemet kan genomgå långsiktiga förändringar och känna igen skillnader mellan gammal och ny lukt.
Nucleus accumbens
Optogenetik, fritt rörligt däggdjursbeteende, in vivo elektrofysiologi och skivfysiologi har integrerats för att undersöka de kolinerga internuronerna i kärnan accumbens genom direkt excitation eller inhibering. Trots att de representerar mindre än 1% av den totala populationen av accumbala neuroner, kan dessa kolinerga celler styra aktiviteten hos de dopaminerga terminalerna som innerverar medelstora nerviga nervceller (MSN) i nucleus accumbens. Dessa accumbal MSN är kända för att vara inblandade i nervbana genom vilken kokain utövar sina effekter, eftersom minskande kokain-inducerade förändringar i aktiviteten för dessa neuroner har visat sig inhiberar kokainkonditionering . De få kolinerga neuroner som finns i kärnan accumbens kan visa sig vara livskraftiga mål för farmakoterapi vid behandling av kokainberoende
Prefrontal cortex
In vivo- och in vitro- inspelningar av enskilda CAMKII AAV-ChR2-uttryckande pyramidala nervceller inom prefrontala cortex visade högfidelitetspotentialeffekt med korta pulser av blått ljus vid 20 Hz ( Figur 1 ).
Motor cortex
In vivo upprepad optogenetisk stimulering hos friska djur kunde så småningom framkalla anfall. Denna modell har kallats optokindling.
Piriform cortex
In vivo upprepad optogenetisk stimulering av pyramidala celler i piriform cortex hos friska djur kunde så småningom framkalla anfall. In vitro -studier har avslöjat en förlust av återkopplingshämning i piriformkretsen på grund av nedsatt GABA -syntes.
Hjärta
Optogenetik applicerades på förmaks -kardiomyocyter för att avsluta arytmier av spiralvågor , som förekommer vid förmaksflimmer , med ljus. Denna metod är fortfarande i utvecklingsstadiet. En ny studie undersökte möjligheterna för optogenetik som en metod för att korrigera för arrytmier och resynkronisera hjärtstimulering. Studien introducerade channelrhodopsin-2 i kardiomyocyter i ventrikulära områden i hjärtan hos transgena möss och utförde in vitro- studier av fotostimulering på både möss med öppen och sluten kavitet. Fotostimulering ledde till ökad aktivering av celler och därmed ökade ventrikelsammandragningar vilket resulterade i ökade hjärtfrekvenser. Dessutom har detta tillvägagångssätt tillämpats i hjärtresynkroniseringsterapi ( CRT ) som en ny biologisk pacemaker som ersättning för elektrodbaserad CRT. På senare tid har optogenetik använts i hjärtat för att defibrillera ventrikulära arytmier med lokal epikardiell belysning, en generaliserad helhjärtsbelysning eller med anpassade stimuleringsmönster baserade på arytmogena mekanismer för att sänka defibrilleringsenergin.
Spiral ganglion
Optogenetisk stimulering av spiralganglion i döva möss återställde hörselaktivitet. Optogenetisk applicering på cochlearegionen möjliggör stimulering eller hämning av spiralganglioncellerna (SGN). På grund av egenskaperna hos vilopotentialerna hos SGN: er har dessutom olika varianter av proteinkanalrhodopsin-2 använts, såsom Chronos, CatCh och f-Chrimson. Chronos- och CatCh -varianter är särskilt användbara genom att de har mindre tid i sina inaktiverade tillstånd, vilket möjliggör mer aktivitet med mindre utbrott av blått ljus. Dessutom möjliggör användning av konstruerade rödskiftade kanaler som f-Chrimson stimulering med längre våglängder, vilket minskar de potentiella riskerna för fototoxicitet på lång sikt utan att kompromissa med grindhastigheten. Resultatet är att lysdioden som producerar ljuset skulle kräva mindre energi och idén om cochlear proteser i samband med fotostimulering skulle vara mer genomförbar.
Hjärnbalk
Optogenetisk stimulering av ett modifierat rött ljus exciterbart channelrhodopsin (ReaChR) uttryckt i ansiktsmotorns kärna möjliggjorde minimalt invasiv aktivering av motoneuroner som är effektiva för att driva morrhårsrörelser hos möss. En ny studie använde optogenetik på Dorsal Raphe Nucleus för att både aktivera och hämma dopaminerg frisättning på det ventrala tegmentområdet. För att producera aktivering infekterades transgena möss med channelrhodopsin-2 med en TH-Cre-promotor och för att producera inhibering tillsattes det hyperpolariserande opsinet NpHR till TH-Cre-promotorn. Resultaten visade att optiskt aktiverande dopaminerga neuroner ledde till en ökning av sociala interaktioner, och deras hämning minskade behovet av att umgås först efter en period av isolering.
Visuellt system
Att studera det visuella systemet med optogenetik kan vara utmanande. Det ljus som används för optogenetisk kontroll kan faktiskt leda till aktivering av fotoreceptorer, som ett resultat av närheten mellan primära visuella kretsar och dessa fotoreceptorer. I detta fall är rumslig selektivitet svår att uppnå (särskilt i fallet med flugoptikloben). Således kräver studiet av det visuella systemet spektral separation, med användning av kanaler som aktiveras av olika våglängder av ljus än rhodopsiner i fotoreceptorerna (toppaktivering vid 480 nm för Rhodopsin 1 i Drosophila ). Rödskiftade CsChrimson eller bistabilt Channelrhodopsin används för optogenetisk aktivering av neuroner (dvs. depolarisering ), eftersom båda möjliggör spektral separation. För att uppnå neuronal tystnad (dvs. hyperpolarisering ) upptäckte en anjonkanalrhodopsin hos kryptofytalgerna Guillardia theta (namnet GtACR1). kan användas. GtACR1 är mer ljuskänslig än andra hämmande kanaler som Halorhodopsin -klassen av kloridpumpar och ger en stark konduktans. Eftersom dess aktiveringstopp (515 nm) är nära Rhodopsin 1, är det nödvändigt att noggrant kalibrera den optogenetiska belysningen såväl som den visuella stimulansen. Faktorerna att ta hänsyn till är våglängden för den optogenetiska belysningen (möjligen högre än aktiveringstoppen för GtACR1), stimulans storlek (för att undvika att kanalerna aktiveras av stimulansljuset) och intensiteten hos den optogenetiska belysning. Det har visat sig att GtACR1 kan vara ett användbart hämmande verktyg i optogenetiska studier av Drosophilas visuella system genom att tysta T4/T5 neurons uttryck. Dessa studier kan också ledas på intakta beteende djur, till exempel för att undersöka optomotoriskt svar .
Exakt tidsmässig kontroll av insatser
De för närvarande tillgängliga optogenetiska ställdonen möjliggör noggrann tidsstyrning av erforderligt ingrepp (dvs inhibering eller excitation av målneuronerna) med precision som rutinmässigt går ner till millisekundnivån. Den tidsmässiga precisionen varierar emellertid mellan optogenetiska ställdon och beror på stimulans frekvens och intensitet.
Experiment kan nu utarbetas där ljuset som används för interventionen utlöses av ett visst element av beteende (för att hämma beteendet), en särskild ovillkorlig stimulans (för att associera något till den stimulansen) eller en viss oscillerande händelse i hjärnan (för att hämma händelsen). Denna typ av tillvägagångssätt har redan använts i flera hjärnregioner:
Hippocampus
Skarpa vågor och krusningskomplex (SWR) är distinkta högfrekventa oscillerande händelser i hippocampus som tros spela en roll i minnesbildning och konsolidering. Dessa händelser kan lätt upptäckas genom att följa de oscillerande cyklerna för den online inspelade lokala fältpotentialen . På detta sätt kan händelsens början användas som en triggersignal för en ljusblixt som styrs tillbaka in i hippocampus för att hämma neuroner specifikt under SWR: erna och även för att optogenetiskt hämma själva oscillationen. Denna typ av experiment med "sluten slinga" är användbar för att studera SWR-komplex och deras roll i minnet.
Cellbiologi/cellsignaleringsvägar
Analogt till hur naturliga ljusgrindade jonkanaler som channelrhodopsin-2 tillåter optisk kontroll av jonflöde, vilket är särskilt användbart inom neurovetenskap, tillåter naturliga ljusstyrda signaltransduktionsproteiner också optisk kontroll av biokemiska vägar, inklusive både andra-messenger-generation och protein-protein-interaktioner, vilket är särskilt användbart för att studera cell- och utvecklingsbiologi. År 2002 demonstrerades det första exemplet på att använda fotoproteiner från en annan organism för att kontrollera en biokemisk väg med hjälp av den ljusinducerade växelverkan mellan växtfytokrom och fytokrominteragerande faktor (PIF) för att kontrollera gentranskription i jäst. Genom fusion av fytokrom till en DNA-bindande domän och PIF till en transkriptionell aktiveringsdomän kan transkriptionell aktivering av gener som känns igen av den DNA-bindande domänen induceras av ljus. Denna studie förutsåg aspekter av den senare utvecklingen av optogenetik i hjärnan, till exempel genom att föreslå att "Riktad ljusleverans av fiberoptik har potential att rikta in sig på utvalda celler eller vävnader, även inom större, mer ogenomskinliga organismer." Litteraturen har varit inkonsekvent om huruvida kontrollen av cellulär biokemi med fotoproteiner ska understrykas inom definitionen av optogenetik, eftersom optogenetik i vanligt bruk specifikt avser kontroll av neuronal eldning med opsins, och som kontroll av neuronal eldning med opsins postdates och använder distinkta mekanismer från kontroll av cellulär biokemi med fotoproteiner.
Fotokänsliga proteiner som används i olika cellsignaleringsvägar
Förutom fytokromer, som finns i växter och cyanobakterier, är LOV-domäner ( Light-oxygen-voltage-sensing domain ) från växter och jäst och kryptokroma domäner från växter andra naturliga fotosensoriska domäner som har använts för optisk kontroll av biokemiska vägar i celler. Dessutom har en syntetisk fotosensorisk domän konstruerats från det fluorescerande proteinet Dronpa för optisk kontroll av biokemiska vägar. I fotosensoriska domäner är ljusabsorption antingen kopplad till en förändring i protein-proteininteraktioner (för fytokromer, vissa LOV-domäner, kryptokromer och Dronpa-mutanter) eller en konformationsförändring som exponerar ett länkat proteinsegment eller förändrar aktiviteten hos en kopplad proteindomän (för fytokromer och vissa LOV -domäner). Ljusreglerade protein-protein-interaktioner kan sedan användas för att rekrytera proteiner till DNA, till exempel för att inducera gentranskription eller DNA-modifieringar, eller till plasmamembranet, till exempel för att aktivera residenta signalproteiner. CRY2 klustrar också när det är aktivt, så det har sammanfogats med signaleringsdomäner och sedan fotoaktiverats för att möjliggöra klusterbaserad aktivering. LOV2-domänen av Avena sativa (vanlig havre) har använts för att avslöja korta peptider eller en aktiv proteindomän på ett ljusberoende sätt. Introduktion av denna LOV -domän till ett annat protein kan reglera funktion genom ljusinducerad peptidstörning. AsLOV2 -proteinet, som optogenetiskt exponerar en peptid, har också använts som en byggnadsställning för flera syntetiska ljusinducerade dimeriserings- och ljusinducerade dissociationssystem (iLID respektive LOVTRAP). Systemen kan användas för att kontrollera proteiner genom en proteinsplitningsstrategi. Fotodissocierbara Dronpa -domäner har också använts för att hålla ett protein aktivt ställe i mörkret, ta bort det efter cyanbelysning och återställa det efter violett ljusbelysning.
Temporär kontroll av signaltransduktion med ljus
Möjligheten att optiskt styra signaler under olika tidsperioder undersöks för att belysa hur cellsignaleringsvägar omvandlar signallängd och svar till olika utgångar. Naturliga signalkaskader kan reagera med olika utgångar på skillnader i stimuleringstid och dynamik. Till exempel leder behandling av PC12-celler med epidermal tillväxtfaktor (EGF, som inducerar en övergående profil av ERK-aktivitet) till cellproliferation medan introduktion av nervtillväxtfaktor (NGF, inducerar en ihållande profil av ERK-aktivitet) leder till differentiering till neuronliknande celler . Detta beteende kännetecknades initialt med EGF- och NGF -applikation, men fyndet har delvis replikerats med optiska ingångar. Dessutom upptäcktes en snabb negativ återkopplingsslinga i RAF-MEK-ERK-vägen med hjälp av pulserande aktivering av en fotoswitchbar RAF konstruerad med fotodissocierbara Dronpa-domäner.
Referenser
Vidare läsning
- Appasani K (2017). Optogenetik: från neuronal funktion till kartläggning och sjukdomsbiologi . Cambridge, Storbritannien: Cambridge University Press. ISBN 978-1-107-05301-4.
- Banerjee S, Mitra D (januari 2020). "Strukturell grund för design och teknik för avancerad växtoptogenetik". Trender inom växtvetenskap . 25 (1): 35–65. doi : 10.1016/j.tplants.2019.10.002 . PMID 31699521 . S2CID 207942668 .
- Hu W, Li Q, Li B, Ma K, Zhang C, Fu X (januari 2020). "Optogenetics kastar nytt ljus på vävnadsteknik och regenerativ medicin". Biomaterial . 227 : 119546. doi : 10.1016/j.biomaterials.2019.119546 . PMID 31655444 . S2CID 204918731 .
- Jarrin S, Finn DP (oktober 2019). "Optogenetik och dess tillämpning vid smärta och ångestforskning". Neurovetenskap och biobehavioral recensioner . 105 : 200–211. doi : 10.1016/j.neubiorev.2019.08.007 . PMID 31421140 . S2CID 199577276 .
- Johnson HE, Toettcher JE (augusti 2018). "Lysande utvecklingsbiologi med cellulär optogenetik" . Aktuellt yttrande inom bioteknik . 52 : 42–48. doi : 10.1016/j.copbio.2018.02.003 . PMC 6082700 . PMID 29505976 .
- Krueger D, Izquierdo E, Viswanathan R, Hartmann J, Pallares Cartes C, De Renzis S (oktober 2019). "Principer och tillämpningar av optogenetik i utvecklingsbiologi" . Utveckling . Cambridge, England. 146 (20): dev175067. doi : 10.1242/dev.175067 . PMC 6914371 . PMID 31641044 .
- Losi A, Gardner KH, Möglich A (november 2018). "Blue-Light-receptorer för optogenetik" . Kemiska recensioner . 118 (21): 10659–10709. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00163 . PMC 6500593 . PMID 29984995 .
- Vriz S, Ozawa T (september 2018). Optogenetik: ljusdrivna ställdon och ljusemitterande sensorer inom cellbiologi . Omfattande serie i fotokemi och fotobiologi. 18 . London: Royal Society of Chemistry. ISBN 978-1-78801-237-9.
- Wittmann T, Dema A, van Haren J (maj 2020). "Ljus, cytoskelet, handling: Optogenetisk kontroll av celldynamik" . Nuvarande åsikt i cellbiologi, tema: celldynamik . Elsevier Ltd. 66 : 1–10. doi : 10.1016/j.ceb.2020.03.003 . PMC 7577957 . PMID 32371345 .
externa länkar
- "Optogenetik: belyser hjärnans hemligheter" . Scientifica .