Riktad differentiering - Directed differentiation
Riktad differentiering är en bioteknik metodik vid gränsytan av stamcellsbiologi , utvecklingsbiologi och vävnadsteknik . Det utnyttjar i huvudsak stamcellernas potential genom att begränsa deras differentiering in vitro mot en specifik celltyp eller vävnad av intresse. Stamceller är per definition pluripotenta , kan differentieras till flera celltyper, såsom neuroner , kardiomyocyter , hepatocyter , etc. Effektiv riktad differentiering kräver en detaljerad förståelse av släktlinjen och cellödebeslut , som ofta tillhandahålls av utvecklingsbiologi.
Konceptuell ram
Under differentiering fattar pluripotenta celler ett antal utvecklingsbeslut för att först generera de tre könsskikten ( ektoderm , mesoderm och endoderm ) i embryot och mellanstadierna, följt av efterföljande beslut eller kontrollpunkter, vilket ger upphov till alla kroppens mogna vävnader. Differentieringsprocessen kan modelleras som en sekvens av binära beslut baserade på probabilistiska eller stokastiska modeller. Utvecklingsbiologi och embryologi ger den grundläggande kunskapen om celltypernas differentiering genom mutationsanalys , släktspårning, mikro-manipulation av embryon och genuttrycksstudier . Celldifferentiering och vävnadsorganinnebära ett begränsat antal utvecklingssignalvägar . Det är således möjligt att styra cellöden genom att kontrollera cellbeslut genom extracellulär signalering, efterlikna utvecklingssignaler.
Källmaterial
Riktad differentiering tillämpas främst på pluripotenta stamceller (PSC) av däggdjursursprung, särskilt musceller och mänskliga celler för biomedicinsk forskning . Sedan upptäckten av embryonala stamceller (ES) (1981) och inducerade pluripotenta stamceller (iPS) (2006) är källmaterialet potentiellt obegränsat. Historiskt sett har också embryonala karcinomceller (EC) använts. Fibroblaster eller andra differentierade celltyper har använts för direkta omprogrammeringsstrategier .
Metoder
Celldifferentiering innebär en övergång från ett proliferativt läge till differentieringsläge. Riktad differentiering består i att efterlikna utvecklingsbeslut (embryos utveckling) beslut in vitro genom att använda stamcellerna som källmaterial. För detta ändamål odlas pluripotenta stamceller (PSC) under kontrollerade förhållanden som involverar specifika substrat eller extracellulära matriser som främjar celladhesion och differentiering och definierar odlingsmediekompositioner . Ett begränsat antal signalfaktorer, såsom tillväxtfaktorer eller små molekyler , som styr celldifferentiering, appliceras sekventiellt eller på ett kombinatoriskt sätt vid varierande dosering och exponeringstid. Korrekt differentiering av celltypen av intresse verifieras genom analys av celltypspecifika markörer , genuttrycksprofil och funktionella analyser.
Tidiga metoder
- samodling med stromceller eller matarkeller och på specifika odlingssubstrat:
stödceller och matriser ger utvecklingsliknande miljösignaler.
- 3D -cellaggregatbildning , benämnd embryoidkroppar (EB): det sammanlagda syftet är att efterlikna tidig embryonisk utveckling och instruera celldifferentiering.
- kultur i närvaro av fetalt bovint serum , avlägsnande av pluripotensfaktorer.
Nuvarande metoder
Riktad differentiering
Denna metod består i att exponera cellerna för specifika signalvägsmodulatorer och manipulera cellodlingsförhållanden (miljömässiga eller exogena) för att efterlikna den naturliga sekvensen av utvecklingsbeslut för att producera en given celltyp/vävnad. En nackdel med detta tillvägagångssätt är nödvändigheten att ha en god förståelse för hur celltypen av intresse bildas.
Direkt omprogrammering
Denna metod, även känd som transdifferentiering eller direktomvandling, består i att överuttrycka en eller flera faktorer, vanligtvis transkriptionsfaktorer, introducerade i cellerna. Utgångsmaterialet kan antingen vara pluripotenta stamceller (PSC) eller antingen differentierad celltyp såsom fibroblaster. Principen demonstrerades först 1987 med de myogena faktorerna MyoD. En nackdel med detta tillvägagångssätt är introduktionen av främmande nukleinsyra i cellerna och det forcerade uttrycket av transkriptionsfaktorer, vilka effekter inte är helt förstått.
Linje-/celltypspecifikt urval
Denna metod består i att välja celltyp av intresse, vanligtvis med antibiotikaresistens . För detta ändamål modifieras källmaterialcellerna så att de innehåller antibiotikaresistenskassett under en målcellsspecifik promotor . Endast celler som är engagerade i släktlinjen av intresse överlever valet .
Ansökningar
Riktad differentiering ger en potentiellt obegränsad och manipulerbar källa till celler och vävnader. Vissa tillämpningar försämras av den omogna fenotypen av de pluripotenta stamcellerna (PSC: er) härledda celltypen, vilket begränsar de möjliga fysiologiska och funktionella studierna. Flera applikationsdomäner framkom:
Modelsystem för grundvetenskap
För grundvetenskap , särskilt utvecklingsbiologi och cellbiologi , tillåter PSC -härledda celler att studera på molekylära och cellulära nivåer grundläggande frågor in vitro, som annars skulle ha varit extremt svåra eller omöjliga att studera av tekniska och etiska skäl in vivo såsom embryonala människans utveckling. I synnerhet är differentierande celler mottagliga för kvantitativa och kvalitativa studier. Mer komplexa processer kan också studeras in vitro och bildning av organoider, inklusive cerebroider, optisk kopp och njure har beskrivits.
Läkemedelsupptäckt och toxikologi
Celltyper som skiljer sig från pluripotenta stamceller (PSC) utvärderas som prekliniska in vitro -modeller av mänskliga sjukdomar. Mänskliga celltyper i en maträtt ger ett alternativ till traditionella prekliniska analyser med djur, mänskliga odödliga celler eller primära kulturer från biopsier , som har sina begränsningar. Kliniskt relevanta celltyper, dvs celltyp som drabbas av sjukdomar, är ett stort fokus för forskning, detta inkluderar hepatocyter , Langerhans holme betaceller , kardiomyocyter och neuroner . Läkemedelsskärm utförs på miniatyriserad cellodling i flerbrunnskivor eller på ett chip.
Sjukdomsmodellering
PSC-härledda celler från patienter används in vitro för att återskapa specifika patologier. Den specifika celltyp som påverkas i patologin ligger i basen av modellen. Till exempel används motoneuroner för att studera spinal muskelatrofi (SMA) och kardiomyocyter används för att studera arrytmi . Detta kan möjliggöra en bättre förståelse av patogenesen och utvecklingen av nya behandlingar genom upptäckt av läkemedel. Omogna PSC-härledda celltyper kan mogna in vitro genom olika strategier, såsom in vitro-åldrande , för att modellera åldersrelaterad sjukdom in vitro. Större sjukdomar som modelleras med PSC-härledda celler är amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers (AD), Parkinsons (PD), bräckligt X-syndrom (FXS), Huntington-sjukdom (HD), Downs syndrom , Spinal muskelatrofi (SMA), muskeldystrofier , cystisk fibros , Long QT -syndrom och typ I -diabetes .
Regenerativ medicin
Den potentiellt obegränsade källan till celler och vävnader kan ha direkt tillämpning för vävnadsteknik , cellersättning och transplantation efter akuta skador och rekonstruktiv kirurgi . Dessa applikationer är begränsade till de celltyper som kan differentieras effektivt och säkert från mänskliga PSC med rätt organogenes . Decellularized organ används också som vävnadsställningar för organogenes. Källmaterial kan vara normala friska celler från en annan donator (heterolog transplantation) eller genetiskt korrigerade från samma patient (autolog). Oron för patientsäkerhet har väckts på grund av möjligheten att förorena odifferentierade celler. Den första kliniska prövningen med hESC-härledda celler var 2011. Den första kliniska prövningen med hiPSC-härledda celler startade 2014 i Japan.