Kryokonservering - Cryopreservation

Rör av biologiska prover placeras i flytande kväve.
Kryogeniskt konserverade prover avlägsnas från en flytande kväve dewar .

Kryokonservering eller kryokonservering är en process där organeller , celler , vävnader , extracellulär matris , organ eller andra biologiska konstruktioner som är mottagliga för skador orsakade av oreglerad kemisk kinetik bevaras genom kylning till mycket låga temperaturer (vanligtvis −80 ° C med användning av fast koldioxid eller −196 ° C med flytande kväve ). Vid tillräckligt låga temperaturer stoppas varje enzymatisk eller kemisk aktivitet som kan orsaka skada på det aktuella biologiska materialet. Kryokonserveringsmetoder försöker nå låga temperaturer utan att orsaka ytterligare skada som orsakas av bildandet av iskristaller under frysning. Traditionell kryokonservering har åberopat beläggning av materialet som ska frysas med en klass av molekyler som kallas kryoskyddande ämnen . Nya metoder utreds på grund av inneboende toxicitet hos många kryoskyddande ämnen. Kryokonservering av animaliska genetiska resurser sker med avsikt att bevara rasen.

Naturlig kryokonservering

Vatten-bears ( Tardigrada ), mikroskopiska flercelliga organismer, kan överleva frysning genom att ersätta de flesta av deras interna vatten med socker trehalos , hindrar det från kristallisation som annars skadar cellmembran . Blandningar av lösta ämnen kan uppnå liknande effekter. Vissa lösta ämnen, inklusive salter, har nackdelen att de kan vara giftiga vid intensiva koncentrationer. Förutom vattenbjörnen kan trä grodor tolerera frysning av deras blod och andra vävnader. Urea ackumuleras i vävnader som förberedelse för övervintring och leverglykogen omvandlas i stora mängder till glukos som svar på inre isbildning. Både urea och glukos fungerar som "kryoprotektanter" för att begränsa mängden is som bildas och för att minska osmotisk krympning av celler. Grodor kan överleva många frys/tina händelser under vintern om inte mer än cirka 65% av det totala kroppsvattnet fryser. Forskning som undersöker fenomenet "frysande grodor" har framför allt utförts av den kanadensiska forskaren, Dr. Kenneth B. Storey .

Frystolerans , där organismer överlever vintern genom att frysa fasta och upphöra med livsfunktioner, är känd hos några ryggradsdjur: fem arter av grodor ( Rana sylvatica , Pseudacris triseriata , Hyla crucifer , Hyla versicolor , Hyla chrysoscelis ), en av salamandrar ( Salamandrella) keyserlingii ), en av ormar ( Thamnophis sirtalis ) och tre av sköldpaddor ( Chrysemys picta , Terrapene carolina , Terrapene ornata ). Snäppsköldpaddor Chelydra serpentina och väggödlor Podarcis muralis överlever också nominell frysning men det har inte fastställts för att vara anpassningsbart för övervintring. När det gäller Rana sylvatica är en kryokonserveringsmedel vanligt glukos, vilket ökar i koncentration med cirka 19 mmol/l när grodorna kyls långsamt.

Historia

Se även: Cryonics § History

En tidig teoretiker för kryokonservering var James Lovelock . År 1953 föreslog han att skador på röda blodkroppar under frysning berodde på osmotisk stress och att ökad saltkoncentration i en uttorkande cell kan skada den. I mitten av 1950-talet experimenterade han med kryokonservering av gnagare och bestämde att hamstrar kunde frysas med 60% av vattnet i hjärnan kristalliserades till is utan några negativa effekter; andra organ visade sig vara mottagliga för skador.

Kryokonservering tillämpades på mänskligt material från 1954 med tre graviditeter till följd av insemination av tidigare frysta spermier. Höns spermier kryokonserverades 1957 av ett team av forskare i Storbritannien regisserat av Christopher Polge . Under 1963 visade Peter Mazur vid Oak Ridge National Laboratory i USA att dödlig intracellulär frysning kunde undvikas om kylningen var tillräckligt långsam för att tillräckligt med vatten skulle kunna lämna cellen under progressiv frysning av den extracellulära vätskan. Den hastigheten skiljer sig mellan celler med olika storlek och vattenpermeabilitet: en typisk kylhastighet runt 1 ° C/minut är lämplig för många däggdjursceller efter behandling med kryoskyddande medel som glycerol eller dimetylsulfoxid, men hastigheten är inte ett universellt optimalt.

Den 22 april 1966 frystes den första människokroppen - även om den hade balsamerats i två månader - genom att placeras i flytande kväve och lagras strax ovanför fryspunkten. Den äldre kvinnan från Los Angeles, vars namn är okänt, tinades snart ut och begravdes av släktingar. Den första människokroppen som frystes med hopp om framtida väckelse var James Bedford , några timmar efter hans cancerframkallade död 1967. Bedford är den enda cryonics- patienten som frystes före 1974 som fortfarande finns kvar idag.

Temperatur

Lagring vid mycket låga temperaturer antas ge cellerna en obestämd livslängd, även om det faktiska effektiva livet är ganska svårt att bevisa. Forskare som experimenterade med torkade frön fann att det fanns en märkbar variation av försämring när prover förvarades vid olika temperaturer-även extremt kalla temperaturer . Temperaturer som är lägre än glasövergångspunkten (Tg) för polyols vattenlösningar, runt −136 ° C (137 K; −213 ° F), tycks accepteras som intervallet där biologisk aktivitet avsevärt saktar ner och −196 ° C (77 K; -321 ° F), kokpunkten för flytande kväve , är den föredragna temperaturen för lagring av viktiga prover. Medan kylskåp , frysar och extra kalla frysar används för många föremål, krävs i allmänhet ultraförkylning av flytande kväve för framgångsrik bevarande av de mer komplexa biologiska strukturerna för att praktiskt taget stoppa all biologisk aktivitet.

Risker

Fenomen som kan orsaka skador på celler under kryokonservering sker huvudsakligen under frysningsstadiet och inkluderar lösningseffekter, extracellulär isbildning, uttorkning och intracellulär isbildning. Många av dessa effekter kan reduceras med kryoskyddande medel . När det bevarade materialet har frusit är det relativt säkert från ytterligare skador.

Lösningseffekter
När iskristaller växer i frysande vatten utesluts lösta ämnen , vilket får dem att koncentreras i det återstående flytande vattnet. Höga koncentrationer av vissa lösta ämnen kan vara mycket skadliga.
Extracellulär isbildning
När vävnader kyls långsamt, vandrar vatten ut ur celler och is bildas i det extracellulära utrymmet. För mycket extracellulär is kan orsaka mekanisk skada på cellmembranet på grund av krossning.
Uttorkning
Migration av vatten, vilket orsakar extracellulär isbildning, kan också orsaka cellulär uttorkning. De associerade påfrestningarna på cellen kan orsaka skador direkt.
Intracellulär isbildning
Medan vissa organismer och vävnader kan tolerera lite extracellulär is, är någon märkbar intracellulär is nästan alltid dödlig för celler.

Huvudsakliga metoder för att förebygga risker

De viktigaste teknikerna för att förhindra kryokonserveringsskador är en väletablerad kombination av kontrollerad hastighet och långsam frysning och en nyare flashfrysningsprocess som kallas vitrifiering .

Långsam programmerbar frysning

En tank med flytande kväve , som används för att leverera en kryogen frys (för förvaring av laboratorieprover vid en temperatur av cirka -150 ° C)

Kontrollerad hastighet och långsam frysning , även känd som långsam programmerbar frysning (SPF) , är en uppsättning väletablerade tekniker som utvecklats under början av 1970-talet som möjliggjorde den första mänskliga embryot frusna födelsen Zoe Leyland under 1984. Sedan dess har maskiner som fryser biologiska prover med hjälp av programmerbara sekvenser, eller kontrollerade hastigheter, har använts över hela världen för mänsklig, djur och cellbiologi - "frysning" av ett prov för att bättre bevara det för eventuell upptining, innan det fryses eller kryokonserveras, i flytande kväve. Sådana maskiner används för frysning av oocyter, hud, blodprodukter, embryon, spermier, stamceller och allmän vävnadsbevarande på sjukhus, veterinärmedicinska och forskningslaboratorier runt om i världen. Som ett exempel uppskattas antalet levande födslar från frysta embryon som är "långsamma frysta" till cirka 300 000 till 400 000 eller 20% av de uppskattade 3 miljoner in vitro -fertiliseringarna ( IVF ).

Dödlig intracellulär frysning kan undvikas om kylningen är tillräckligt långsam för att tillåta tillräckligt med vatten att lämna cellen under progressiv frysning av den extracellulära vätskan. För att minimera tillväxten av extracellulära iskristaller och omkristallisation kan biomaterial som alginater , polyvinylalkohol eller kitosan användas för att hindra iskristalltillväxt tillsammans med traditionella småmolekylära kryoskyddande medel. Att hastighets skiljer mellan celler av olika storlek och vatten permeabilitet : en typisk kylningshastighet av omkring 1 ° C / minut är lämplig för många däggdjursceller efter behandling med kryoskyddsmedel såsom glycerol eller dimetylsulfoxid , men priset är inte en universell optimum. Hastigheten 1 ° C / minut kan uppnås genom att använda enheter som en hastighetsstyrd frys eller en bärbar frysbehållare.

Flera oberoende studier har visat att frysta embryon lagrade med långsam frysningsteknik på vissa sätt kan vara "bättre" än färska i IVF. Studierna indikerar att användning av frysta embryon och ägg snarare än färska embryon och ägg minskade risken för dödfödelse och för tidig förlossning även om de exakta orsakerna fortfarande undersöks.

Förglasning

Forskarna Greg Fahy och William F. Rall hjälpte till att införa vitrifiering till reproduktiv kryokonservering i mitten av 1980-talet. Från och med 2000 hävdar forskare att vitrifiering ger fördelarna med kryokonservering utan skada på grund av iskristallbildning. Situationen blev mer komplex med utvecklingen av vävnadsteknik eftersom både celler och biomaterial måste förbli isfria för att bevara hög cellviabilitet och funktioner, konstruktioners integritet och biomaterials struktur. Förglasning av vävnadstekniska konstruktioner rapporterades först av Lilia Kuleshova, som också var den första forskaren som uppnådde vitrifiering av oocyter , vilket resulterade i levande födelse 1999. För klinisk kryokonservering kräver vanligen vitrifiering tillsats av kryoskyddande medel före kylning. Kryoprotektanter är makromolekyler som tillsätts till frysmediet för att skydda cellerna från de skadliga effekterna av intracellulär iskristallbildning eller från lösningseffekterna under frysning och upptining. De tillåter en högre grad av cellöverlevnad under frysning, för att sänka fryspunkten, för att skydda cellmembranet mot frysrelaterad skada. Kryoskyddande medel har hög löslighet, låg toxicitet vid höga koncentrationer, låg molekylvikt och förmågan att interagera med vatten via vätebindning.

I stället för att kristallisera blir den sirapslösa lösningen en amorf is - det förglasas . I stället för en fasförändring från vätska till fast material genom kristallisation är det amorfa tillståndet som en "fast vätska", och transformationen sker över ett litet temperaturintervall som beskrivs som " glasövergång " -temperaturen.

Vitrifiering av vatten främjas av snabb kylning och kan uppnås utan kryoskydd genom en extremt snabb temperaturminskning (megakelvin per sekund). Den hastighet som krävs för att uppnå glasartat tillstånd i rent vatten ansågs vara omöjligt fram till 2005.

Två förhållanden som vanligtvis krävs för att tillåta förglasning är en ökning av viskositeten och en minskning av frysningstemperaturen. Många lösta ämnen gör båda, men större molekyler har i allmänhet en större effekt, särskilt på viskositeten. Snabb kylning främjar också förglasning.

För etablerade metoder för kryokonservering måste det lösta ämnet penetrera cellmembranet för att uppnå ökad viskositet och minska frysningstemperaturen inuti cellen. Socker tränger inte lätt igenom membranet. De lösta ämnen som gör det, såsom dimetylsulfoxid , ett vanligt kryoskyddande medel, är ofta giftiga i intensiv koncentration. En av de svåra kompromisserna med förglasning av kryokonservering handlar om att begränsa skadorna från själva kryoskyddet på grund av kryoskyddstoxicitet. Blandningar av kryoskyddande medel och användningen av isblockerare har gjort det möjligt för företaget Twenty-First Century Medicine att förglasa en kanin njure till −135 ° C med sin egen vitrifikationsblandning. Vid uppvärmning transplanterades njuren framgångsrikt till en kanin, med fullständig funktionalitet och livskraft, som kunde upprätthålla kaninen på obestämd tid som den enda fungerande njuren. År 2000 blev FM-2030 den första människan som framgångsrikt förglasades posthumt.

Persufflation

Blod kan ersättas med inerta ädelgaser och/eller metaboliskt vitala gaser som syre , så att organ kan svalna snabbare och mindre frostskyddsmedel behövs. Eftersom vävnadsområden separeras med gas, ackumuleras inte små expansioner, vilket skyddar mot krossning. Ett litet företag, Arigos Biomedical, "har redan återhämtat grishjärtan från 120 minusgrader", även om definitionen av "återhämtad" inte är klar. Ett tryck på 60 atm kan hjälpa till att öka värmeväxlingen. Gasformig syreperfusion/persufflation kan förbättra organkonservering i förhållande till statisk kylförvaring eller hypotermisk maskinperfusion, eftersom gasernas lägre viskositet kan hjälpa till att nå fler regioner av bevarade organ och leverera mer syre per gram vävnad.

Frysta vävnader

I allmänhet är kryokonservering enklare för tunna prover och suspenderade celler, eftersom dessa kan kylas snabbare och kräver därför mindre doser av giftiga kryoskyddande medel. Därför är kryokonservering av mänskliga lever och hjärtan för lagring och transplantation fortfarande opraktiskt.

Ändå möjliggör lämpliga kombinationer av kryoskyddande medel och regleringar för kylning och sköljning under uppvärmning ofta framgångsrik kryokonservering av biologiska material, särskilt cellsuspensioner eller tunna vävnadsprover. Exempel inkluderar:

Embryon

Huvudartikel: Embryokryokonservering

Kryokonservering för embryon används för embryolagring, t.ex. när in vitro -fertilisering (IVF) har resulterat i fler embryon än vad som för närvarande behövs.

En graviditet och en hälsosam födelse har rapporterats från ett embryo som lagrats i 27 år, efter ett lyckat graviditet av ett embryo från samma sats tre år tidigare. Många studier har utvärderat barn födda från frysta embryon, eller "frost". Resultatet har varit enhetligt positivt utan att fosterskador eller utvecklingsavvikelser har ökat. En studie av mer än 11 ​​000 kryokonserverade mänskliga embryon visade ingen signifikant effekt av lagringstid på överlevnad efter upptining för IVF- eller äggdonationscykler, eller för embryon som frystes vid pronukleära eller klyvningsstadier. Dessutom hade lagringstiden ingen signifikant effekt på klinisk graviditet, missfall, implantation eller levande födelsetal, vare sig från IVF- eller äggdonationscykler. Oocytålder, överlevnadsandel och antal överförda embryon är snarare förutsägare för graviditetsutfall.

Äggstocksvävnad

Huvudartikel: Ovarian tissue cryopreservation

Kryokonservering av äggstocksvävnad är av intresse för kvinnor som vill bevara sin reproduktiva funktion utöver den naturliga gränsen, eller vars reproduktiva potential hotas av cancerterapi, till exempel vid hematologiska maligniteter eller bröstcancer. Proceduren är att ta en del av äggstocken och utföra långsam frysning innan den lagras i flytande kväve medan behandlingen pågår. Vävnad kan sedan tinas och implanteras nära äggledaren, antingen ortotopiskt (på den naturliga platsen) eller heterotopiskt (på bukväggen), där det börjar producera nya ägg, vilket tillåter normal befruktning. Äggstocksvävnaden kan också transplanteras till möss som är immunkompromitterade ( SCID -möss ) för att undvika transplantatavstötning och vävnad kan skördas senare när mogna folliklar har utvecklats.

Oocyter

Huvudartikel: Oocytkryokonservering

Människo -oocytkryokonservering är en ny teknik där en kvinnas ägg ( oocyter ) extraheras, fryses och lagras. Senare, när hon är redo att bli gravid, kan äggen tinas, befruktas och överföras till livmodern som embryon . Sedan 1999, när födelsen av den första bebisen från ett embryo som härrör från förglasade värmda kvinnas ägg rapporterades av Kuleshova och medarbetare i tidskriften för mänsklig reproduktion, har detta koncept varit erkänt och utbrett. Detta genombrott för att uppnå vitrifiering av en kvinnas oocyter gjorde ett viktigt framsteg i vår kunskap och praktik om IVF -processen, eftersom den kliniska graviditetsfrekvensen är fyra gånger högre efter äggförglasning än efter långsam frysning. Oocytförglasning är avgörande för att bevara fertiliteten hos unga onkologipatienter och för individer som genomgår IVF som av antingen religiösa eller etiska skäl motsätter sig att frysa embryon.

Sädesvätska

Huvudartikel: Krympreservering av sperma

Sperma kan användas framgångsrikt nästan på obestämd tid efter kryokonservering. Den längsta rapporterade framgångsrika lagringen är 22 år. Det kan användas för spermadonation där mottagaren vill ha behandlingen på en annan tid eller annan plats eller som ett sätt att bevara fertiliteten för män som genomgår vasektomi eller behandlingar som kan äventyra deras fertilitet, till exempel kemoterapi , strålbehandling eller kirurgi.

Testikelvävnad

Huvudartikel: Kryokonservering av testikelvävnad

Kryokonservering av omogen testikelvävnad är en utvecklingsmetod för att använda reproduktion till unga pojkar som behöver gonadotoxisk behandling. Djurdata är lovande eftersom friska avkommor har erhållits efter transplantation av frusna testikelcellsuspensioner eller vävnadsbitar. Inga av fertilitetsåterställningsalternativen från frusen vävnad, dvs cellsuspensionstransplantation, vävnadstransplantation och in vitro -mognad (IVM) har ännu visat sig vara effektiva och säkra hos människor.

Mossa

Fyra olika ekotyper av Physcomitrella patens lagrade vid IMSC .

Kryokonservering av hela mossa växter , särskilt Physcomitrella paténs , har utvecklats av Ralf Reski och medarbetare och utförs vid International Moss Stock Center . Denna biobank samlar, bevarar och distribuerar mossmutanter och mossekotyper .

Mesenkymala stromaceller (MSC)

MSC, om de transfunderas omedelbart inom några timmar efter upptining, kan visa nedsatt funktion eller visa minskad effekt vid behandling av sjukdomar jämfört med MSC som är i logfas av celltillväxt (färsk). Som ett resultat bör kryokonserverade MSC återföras till logfasen för celltillväxt i in vitro -kultur innan dessa administreras för kliniska prövningar eller experimentella terapier. Återodling av MSC hjälper till att återhämta sig efter den chock cellerna får under frysning och upptining. Olika kliniska prövningar på MSC har misslyckats som använde kryokonserverade produkter omedelbart efter upptining jämfört med de kliniska prövningarna som använde färska MSC.

Bevarande av mikrobiologiska kulturer

Bakterier och svampar kan hållas kylda (månader till cirka ett år beroende), men celldelning och ämnesomsättning stoppas inte helt och är därför inte ett optimalt alternativ för långtidsförvaring (år) eller för att bevara kulturer genetiskt eller fenotypiskt, eftersom celldelningar kan leda till mutationer eller subodling kan orsaka fenotypiska förändringar. Ett föredraget alternativ, artberoende, är kryokonservering. Nematodmaskar är de enda flercelliga eukaryoter som har visat sig överleva kryokonservering. Shatilovich AV, Tchesunov AV, Neretina TV, Grabarnik IP, Gubin SV, Vishnivetskaya TA, Onstott TC, Rivkina EM (maj 2018). "Livskraftiga nematoder från sen Pleistocen Permafrost vid Kolyma River Lowland". Doklady Biologiska vetenskaper . 480 (1): 100–102. doi : 10.1134/S0012496618030079 . PMID  30009350 . S2CID  49743808 .

Svampar

Svampar, särskilt zygomyceter, ascomyceter och högre basidiomyceter, oavsett sporulering, kan lagras i flytande kväve eller frysas. Kryokonservering är en kännetecknande metod för svampar som inte sporulerar (annars kan andra konserveringsmetoder för sporer användas till lägre kostnader och lättare), sporulera men har känsliga sporer (stora eller frystorkade), är patogena (farligt att hålla metaboliskt aktiva svamp) eller ska användas för genetiska bestånd (helst för att ha en identisk sammansättning som den ursprungliga fyndigheten). Som med många andra organismer används kryoskyddande medel som DMSO eller glycerol (t.ex. trådsvampar 10% glycerol eller jäst 20% glycerol). Skillnaderna mellan att välja kryoprotektanter är arter (eller klass) beroende, men generellt för svampar är penetrerande kryoprotektanter som DMSO, glycerol eller polyetylenglykol mest effektiva (andra icke-penetrerande inkluderar socker mannitol, sorbitol, dextran, etc.). Frys-tina-upprepning rekommenderas inte eftersom det kan minska livskraften. Säkerhetskopierade djupfrysar eller lagringsplatser för flytande kväve rekommenderas. Flera protokoll för frysning sammanfattas nedan (var och en använder kryprör av polypropen med skruvlock):

Bakterie

Många vanliga odlingsbara laboratoriestammar är djupfrysta för att bevara genetiskt och fenotypiskt stabila, långsiktiga bestånd. Underodling och förlängda kylprover kan leda till förlust av plasmid (er) eller mutationer. Vanliga slutliga glycerolprocent är 15, 20 och 25. Från en ny odlingsplatta väljs en enda intressekoloni och flytande kultur görs. Från vätskekulturen blandas mediet direkt med en lika stor mängd glycerol; kolonin bör kontrolleras för eventuella defekter som mutationer. Alla antibiotika ska tvättas från kulturen före långtidsförvaring. Metoderna varierar, men blandning kan göras försiktigt genom inversion eller snabbt genom virvel och kylning kan variera genom att antingen placera kryotröret direkt vid −50 till −95 ° C, stötfrysning i flytande kväve eller gradvis kyla och sedan lagra vid −80 ° C eller svalare (flytande kväve eller flytande kväveånga). Återhämtning av bakterier kan också variera, nämligen om pärlor lagras inuti röret kan de få pärlorna användas för att platta eller det frysta materialet kan skrapas med en ögla och sedan pläteras, eftersom endast lite lager behövs hela röret ska aldrig tinas helt och upprepad frysning bör undvikas. 100% återhämtning är inte genomförbar oavsett metod.

Frystolerans hos djur

Maskar

De mikroskopiska jordlevande nematod rundmaskar Panagrolaimus detritophagus och Plectus Parvus är de enda eukaryota organismer som har visat sig vara lönsamt efter långvarig frysförvaring hittills. I detta fall var konserveringen naturlig snarare än artificiell på grund av permafrost .

Ryggradsdjur

Flera djurarter, inklusive fisk, amfibier och reptiler har visat sig tåla frysning. Dessa arter inkluderar minst fyra arter av grodor ( Pseudacris crucifer , Hyla versicolor , Pseudacris triseriata , Lithobates sylvaticus ) och flera arter av sköldpaddor ( Terrapene carolina , kläckande Chrysemys picta ), ödlor och ormar är frystoleranta och har utvecklat anpassningar för överlevande frysning . Medan vissa grodor övervintrar under jorden eller i vatten, sjunker kroppstemperaturerna fortfarande till −5 till −7 ° C, vilket får dem att frysa. Den Wood groda (lithobates sylvaticus) kan motstå upprepad frysning, under vilken ca 65% av dess extracellulära vätskan omvandlas till is.

Se även

Referenser

Vidare läsning