Gramfläck - Gram stain
Gramfläck eller Gramfärgning , även kallad Grams metod , är en färgningsmetod som används för att skilja och klassificera bakteriearter i två stora grupper: grampositiva bakterier och gramnegativa bakterier . Namnet kommer från den danske bakteriologen Hans Christian Gram , som utvecklade tekniken.
Gramfärgning differentierar bakterier genom de kemiska och fysikaliska egenskaperna hos deras cellväggar . Grampositiva celler har ett tjockt lager av peptidoglykan i cellväggen som behåller den primära fläcken, kristallviolett . Gramnegativa celler har ett tunnare peptidoglykanskikt som gör att kristallviolett kan tvätta ut vid tillsats av etanol. De är färgade rosa eller röda av motfärgen , vanligen safranin eller fuchsine . Lugols jodlösning tillsätts alltid efter tillsats av kristallviolett för att stärka fläckens bindningar med cellmembranet. Gramfärgning är nästan alltid det första steget i den preliminära identifieringen av en bakteriell organism. Medan Gram -färgning är ett värdefullt diagnostiskt verktyg i både kliniska och forskningsinställningar, kan inte alla bakterier definitivt klassificeras med denna teknik. Detta ger upphov till gram-variabla och gram-obestämda grupper.
Historia
Metoden är uppkallad efter dess uppfinnare, den danska vetenskapsmannen Hans Christian Gram (1853–1938), som utvecklade tekniken medan han arbetade med Carl Friedländer i likhuset på stadssjukhuset i Berlin 1884. Gram utformade sin teknik inte för att särskilja en typ av bakterier från en annan men för att göra bakterier mer synliga i färgade delar av lungvävnad. Han publicerade sin metod 1884 och ingår i hans kort rapport iakttagelsen att tyfus bacill inte behålla fläcken.
Användningsområden
Gramfärgning är en bakteriologisk laboratorieteknik som används för att differentiera bakteriearter i två stora grupper ( grampositiva och gramnegativa ) baserat på deras cellväggars fysiska egenskaper . Gramfärgning används inte för att klassificera archaea , tidigare archaeabacteria, eftersom dessa mikroorganismer ger mycket varierande svar som inte följer deras fylogenetiska grupper .
Vissa organismer är gram-variabla (vilket betyder att de kan färgas antingen negativt eller positivt); vissa är inte färgade med något färgämne som används i Gram -tekniken och syns inte. I ett modernt miljö- eller molekylärt mikrobiologilaboratorium görs mest identifiering med hjälp av genetiska sekvenser och andra molekylära tekniker, som är mycket mer specifika och informativa än differentiell färgning.
Medicinsk
Gramfläckar utförs på kroppsvätska eller biopsi vid misstanke om infektion . Gramfläckar ger resultat mycket snabbare än odling , och är särskilt viktiga när infektion skulle göra en viktig skillnad i patientens behandling och prognos; exempel är cerebrospinalvätska för hjärnhinneinflammation och ledvätska för septisk artrit .
Färgningsmekanism
Grampositiva bakterier har en tjock nätliknande cellvägg av peptidoglykan (50–90% av cellhöljet), och som ett resultat färgas de lila av kristallviolett, medan gramnegativa bakterier har ett tunnare lager (10% av cell kuvert), så behåll inte den lila fläcken och är motfärgade rosa av safranin. Det finns fyra grundläggande steg i Gram -fläcken:
- Applicera en primär fläck ( kristallviolett ) på ett värmefixerat utstryk av en bakteriekultur. Värmefixering dödar vissa bakterier men används mest för att fästa bakterierna på bilden så att de inte sköljs ut under färgningsförfarandet.
- Tillsatsen av jod , som binder till kristallviolett och fångar det i cellen
- Snabb avfärgning med etanol eller aceton
- Motfärgning med safranin . Carbol fuchsin ersätts ibland med safranin eftersom det mer intensivt fläckar anaeroba bakterier, men det används mindre vanligt som motfärg.
| Tillämpning av | Reagens | Cellfärg | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Gram positiv | Gram-negativ | ||||
| Primärt färgämne | kristallviolett | lila | lila | ||
| bitande | jod | lila | lila | ||
| Avfärgare | alkohol / aceton | lila | färglös | ||
| Motfläck | safranin / carbol fuchsin | lila | rosa eller rött | ||
Kristallviolett (CV) dissocierar i vattenlösning till CV+
och klorid ( Cl-
) joner. Dessa joner penetrerar cellväggen hos både grampositiva och gramnegativa celler. den CV+
jon interagerar med negativt laddade komponenter i bakterieceller och färgar cellerna lila.
Jodid ( jag-
eller jag-
3) interagerar med CV+
och bildar stora komplex av kristallviolett och jod (CV – I) inom cellens inre och yttre skikt. Jod kallas ofta som ett betande medel, men är ett infångningsmedel som förhindrar avlägsnande av CV -I -komplexet och därför färgar cellen.
När en avfärgare som alkohol eller aceton tillsätts interagerar den med cellmembranets lipider. En gramnegativ cell förlorar sitt yttre lipopolysackaridmembran och det inre peptidoglykanskiktet lämnas utsatt. CV-I-komplexen tvättas från den gramnegativa cellen tillsammans med det yttre membranet. Däremot dehydratiseras en grampositiv cell från en etanolbehandling. De stora CV – I-komplexen fastnar i den grampositiva cellen på grund av dess peptidoglykans flerskiktiga natur. Avfärgningssteget är kritiskt och måste tidsinställas korrekt. den kristallvioletta fläcken avlägsnas från både grampositiva och negativa celler om avfärgningsmedlet får stå kvar för länge (några sekunder).
Efter avfärgning förblir den grampositiva cellen lila och den gramnegativa cellen förlorar sin lila färg. Motfärg, som vanligtvis är positivt laddad safranin eller basisk fuchsin, appliceras sist för att ge avfärgade gramnegativa bakterier en rosa eller röd färg. Både grampositiva bakterier och gramnegativa bakterier tar upp motfärgen. Motfärgen syns dock inte på grampositiva bakterier på grund av den mörkare kristallvioletta fläcken.
Exempel
Grampositiva bakterier
Grampositiva bakterier har i allmänhet ett enda membran ( monoderm ) omgivet av ett tjockt peptidoglykan. Denna regel följs av två phyla: Firmicutes (förutom klasserna Mollicutes och Negativicutes ) och Actinobacteria . Däremot är medlemmar av Chloroflexi (gröna icke-svavelbakterier) monoderma men har en tunn eller frånvarande peptidoglykan (klass Dehalococcoidetes ) och kan färgas negativt, positivt eller obestämt; medlemmar av Deinococcus-Thermus grupp fläck positiv men är diderms med en tjock peptidoglykan.
Historiskt sett utgjorde de gram-positiva formerna phylum Firmicutes , ett namn som nu används för den största gruppen. Den innehåller många välkända släkten som Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus och Clostridium . Det har också utökats till att inkludera Mollicutes, bakterier som Mycoplasma och Thermoplasma som saknar cellväggar och därför inte kan färgas med gram, men härrör från sådana former.
Vissa bakterier har cellväggar som är särskilt skickliga på att behålla fläckar. Dessa kommer att verka positiva med Gram-färgning trots att de inte är nära besläktade med andra grampositiva bakterier. Dessa kallas syrafasta bakterier och kan endast särskiljas från andra grampositiva bakterier genom särskilda färgningsförfaranden .
Gramnegativa bakterier
Gramnegativa bakterier har i allmänhet ett tunt lager av peptidoglykan mellan två membran ( diderm ). Lipopolysackarid (LPS) är det mest förekommande antigenet på cellytan hos de flesta gramnegativa bakterier och bidrar med upp till 80% av det yttre membranet av E. coli och Salmonella . De flesta bakteriefyla är gramnegativa, inklusive cyanobakterier , gröna svavelbakterier och de flesta Proteobakterier (undantag är vissa medlemmar av Rickettsiales och insekt-endosymbionterna av Enterobacteriales ).
Gramvariabel och Gram-obestämda bakterier
Vissa bakterier, efter färgning med Gram-fläcken, ger ett gram-variabelt mönster: en blandning av rosa och lila celler syns. I kulturer av Bacillus, Butyrivibrio och Clostridium sammanfaller en minskning av peptidoglycan-tjockleken under tillväxten med en ökning av antalet celler som färgar gramnegativa. Dessutom kan i alla bakterier som färgas med Gram -fläcken odlingsåldern påverka fläckens resultat.
Gram-obestämda bakterier svarar inte förutsägbart på Gram-färgning och kan därför inte bestämmas som varken gram-positiva eller gram-negativa. Exempel inkluderar många arter av Mycobacterium , inklusive Mycobacterium bovis , Mycobactrium leprae och Mycobacterium tuberculosis , varav de två senare är orsaksmedlen för spetälska respektive tuberkulos. Bakterier av släktet Mycoplasma saknar en cellvägg runt sina cellmembran , vilket innebär att de inte fläckar med Grams metod och är resistenta mot antibiotika som riktar cellväggssyntes.
Ortografisk anteckning
Termen Gramfärgning härrör från Hans Christian Grams efternamn ; den eponym (Gram) är därför aktiveras men inte vanligt substantiv (fläck) som är vanligt för vetenskapliga termer. De inledande bokstäverna för gram-positiva och gram-negativa , som är eponymous adjektiv , kan antingen vara versaler G eller gemener g , beroende på vilken stilguide (om någon) styr det dokument som skrivs. Liten stil används av US Centers for Disease Control and Prevention och andra stilregimer som AMA -stilen . Ordböcker kan använda gemener, versaler eller båda. Versaler grampositiva eller gramnegativa användning är också vanligt i många vetenskapliga tidskriftsartiklar och publikationer. När artiklar skickas till tidskrifter kan varje tidskrift tillämpa egen stil på eftertrycksversionen . Förtrycksversioner innehåller vilken stil som författaren råkade använda. Även stilregimer som använder gemener för adjektiverna gram-positiva och gramnegativa använder fortfarande typiskt kapital för Gram-färgning .