4Pi mikroskop - 4Pi microscope
Ett 4Pi -mikroskop är ett laserskannande fluorescensmikroskop med en förbättrad axiell upplösning . Med det typiska området av den axiella upplösningen av 500-700 nm kan förbättras till 100-150 nm, vilket motsvarar en nästan sfärisk fokal fläck med 5-7 gånger mindre volym än den hos standard konfokalmikroskopi .
Arbetsprincip
Förbättringen i upplösning uppnås genom att använda två motstående objektiv, som båda är fokuserade på samma geometriska plats. Även skillnaden i optisk väglängd genom var och en av de två objektivlinserna är noggrant inriktad för att vara minimal. Genom denna metod kan molekyler som bor i det gemensamma fokalområdet för båda målen belysas koherent från båda sidor och det reflekterade eller avgivna ljuset kan också samlas samman, dvs. koherent överlagring av utsänt ljus på detektorn är möjlig. Den fasta vinkel som används för belysning och detektion ökar och närmar sig sitt maximalt. I detta fall belyses provet och detekteras från alla sidor samtidigt.
Driftläget för ett 4Pi -mikroskop visas i figuren. Laserljuset delas av en stråldelare och riktas av speglar mot de två motsatta objektivlinserna. Vid den gemensamma kontaktpunkten uppstår superposition av båda fokuserade ljusstrålarna. Upprymda molekyler vid denna position avger fluorescensljus, som samlas upp av båda objektivlinserna, kombineras av samma stråldelare och avböjs av en dikroisk spegel på en detektor. Där kan överlagring av båda emitterade ljusvägarna äga rum igen.
I idealfallet kan varje objektivlins samla ljus från en fast vinkel på . Med två objektiv kan man samla från alla håll (fast vinkel ). Namnet på denna typ av mikroskopi härleds från den maximala möjliga fasta vinkeln för excitation och detektion. Praktiskt taget kan man endast uppnå bländarvinklar på cirka 140 ° för ett objektiv, vilket motsvarar .
Mikroskopet kan manövreras på tre olika sätt: I ett 4Pi -mikroskop av typ A används den koherenta superpositionen av excitationsljus för att generera den ökade upplösningen. Emissionsljuset detekteras antingen från ena sidan eller i en osammanhängande superposition från båda sidor. I ett 4Pi -mikroskop av typ B stör endast utsläppsljuset. När den används i typ C-läge får både excitation och emissionsljus störa, vilket leder till högsta möjliga upplösningsökning (~ 7-faldig längs den optiska axeln jämfört med konfokalmikroskopi).
I ett riktigt 4Pi-mikroskop kan ljus inte appliceras eller samlas in från alla riktningar lika, vilket leder till så kallade sidlobar i punktspridningsfunktionen . Typiskt (men inte alltid) två-foton excitationsmikroskopi används i ett 4Pi-mikroskop i kombination med ett utsläppshål för att sänka dessa sidolober till en acceptabel nivå.
Historia
År 1971 föreslog Christoph Cremer och Thomas Cremer skapandet av ett perfekt hologram , det vill säga ett som bär hela fältinformationen om utsläpp av en punktkälla i alla riktningar, ett så kallat hologram. Men publikationen från 1978 hade dragit en felaktig fysisk slutsats (dvs en punktliknande ljuspunkt) och hade helt missat den axiella upplösningsökningen som den verkliga fördelen med att lägga till den andra sidan av den fasta vinkeln. Den första beskrivningen av ett praktiskt system för 4Pi -mikroskopi, dvs installationen med två motstående, störande linser, uppfanns av Stefan Hell 1991. Han demonstrerade det experimentellt 1994.
Under de följande åren har antalet applikationer för detta mikroskop ökat. Till exempel resulterade parallell excitation och detektion med 64 fläckar i provet samtidigt i kombination med den förbättrade rumsliga upplösningen i en framgångsrik registrering av mitokondriernas dynamik i jästceller med ett 4Pi -mikroskop 2002. En kommersiell version lanserades av mikroskoptillverkaren Leica Microsystems 2004 och avbröts senare.
Hittills nåddes den bästa kvaliteten i ett 4Pi-mikroskop i kombination med superupplösningstekniker som principen för stimulerad utsläppsutarmning (STED). Med hjälp av ett 4Pi-mikroskop med lämpliga excitations- och de-excitationsstrålar var det möjligt att skapa en likformig 50 nm stor plats, vilket motsvarar en minskad fokalvolym jämfört med konfokalmikroskopi med en faktor 150–200 i fasta celler. Med kombinationen av 4Pi -mikroskopi och RESOLFT -mikroskopi med omkopplingsbara proteiner är det nu möjligt att ta bilder av levande celler vid låga ljusnivåer med isotropa upplösningar under 40 nm.