Hybridisering in situ - In situ hybridization

RNA in situ hybridisering - KRT5 och hushållningsgen i mänskligt melanom FFPE -vävnadssnitt - visualiserat under brightfield och fluorescensmikroskop
Multiplex RNA -visualisering i celler med ViewRNA FISH -analyser
In situ hybridisering av vildtyp Drosophila -embryon vid olika utvecklingsstadier för RNA från en gen som kallas knuckel.

In situ hybridisering (ISH) är en typ av hybridisering som använder ett märkt komplementärt DNA , RNA eller modifierad nukleinsyrasträng (dvs sond ) för att lokalisera ett specifikt DNA eller RNA -sekvens i en del eller del av vävnad ( in situ ) eller om vävnaden är tillräckligt liten (t.ex. växtfrön, Drosophila -embryon), i hela vävnaden (helmonterad ISH), i celler och i cirkulerande tumörceller (CTC). Detta skiljer sig från immunhistokemi , som vanligtvis lokaliserar proteiner i vävnadssektioner.

In situ -hybridisering används för att avslöja platsen för specifika nukleinsyrasekvenser på kromosomer eller i vävnader, ett avgörande steg för att förstå generers organisation, reglering och funktion. De viktigaste teknikerna som för närvarande används inkluderar in situ- hybridisering till mRNA med oligonukleotid- och RNA-sonder (både radiomärkta och haptenmärkta), analys med ljus- och elektronmikroskop, helmonterad in situ- hybridisering, dubbel detektion av RNA och RNA plus protein, och fluorescerande in situ -hybridisering för att detektera kromosomala sekvenser. DNA ISH kan användas för att bestämma kromosomernas struktur . Fluorescerande DNA ISH (FISH) kan till exempel användas i medicinsk diagnostik för att bedöma kromosomintegritet. RNA ISH (RNA in situ hybridisering) används för att mäta och lokalisera RNA (mRNA, lncRNA och miRNA) inom vävnadssektioner, celler, hela fästen och cirkulerande tumörceller (CTC). Hybridisering på plats uppfanns av den franske biologen Mary-Lou Pardue och Joseph G. Gall .

Utmaningar med hybridisering på plats

In situ hybridisering är en kraftfull teknik för att identifiera specifika mRNA -arter inom enskilda celler i vävnadssektioner, vilket ger insikter om fysiologiska processer och sjukdomspatogenes. Men in situ hybridisering kräver att många steg tas med exakt optimering för varje undersökt vävnad och för varje sond som används. För att bevara mål -mRNA i vävnader krävs ofta att tvärbindande fixeringsmedel (t.ex. formaldehyd ) används.

Dessutom kräver hybridisering på plats på vävnadssektioner att vävnadsskivor är mycket tunna, vanligtvis 3 µm till 7 µm i tjocklek. Vanliga metoder för att förbereda vävnadssektioner för hybridiseringsprocess in situ inkluderar skärprover med en kryostat eller en vävnadsskärare från Compresstome . En kryostat tar färsk eller fast vävnad och sänker ner den i flytande kväve för snabbfrysning. Sedan är vävnad inbäddad i frysmedia som kallas OCT och tunna sektioner skärs. Hinder inkluderar att få frysa artefakter på vävnad som kan störa korrekt mRNA -färgning. Den Compresstome skär vävnaden i tunna skivor utan en frysprocess; fritt flytande sektioner skärs efter att de har lagts in i agaros för stabilitet. Denna metod undviker frysning av vävnad och därmed associerade frysartefakter. Processen är permanent och irreversibel när den är klar.

Bearbeta

För hybridisering histokemi är prov celler och vävnader behandlas vanligen för att fixera mål utskrifter på plats och för att öka tillgängligheten av sonden. Som nämnts ovan är sonden antingen ett märkt komplementärt DNA eller, nu vanligast, ett komplementärt RNA ( riboprobe ). Sonden hybridiserar till målsekvensen vid förhöjd temperatur, och sedan tvättas överskottssonden bort (efter tidigare hydrolys med användning av RNas vid ohybridiserat överskott av RNA -sond). Lösningsparametrar som temperatur, salt och/eller tvättmedelskoncentration kan manipuleras för att avlägsna eventuella icke-identiska interaktioner (dvs endast exakta sekvensmatchningar förblir bundna). Därefter lokaliseras och kvantifieras sonden som var märkt med antingen radio-, fluorescerande eller antigenmärkta baser (t.ex. digoxigenin ) i vävnaden med antingen autoradiografi , fluorescensmikroskopi eller immunhistokemi . ISH kan också använda två eller flera sonder, märkta med radioaktivitet eller andra icke-radioaktiva etiketter, för att samtidigt upptäcka två eller flera transkript.

En alternativ teknik, grenad DNA -analys , kan användas för RNA (mRNA, lncRNA och miRNA) in situ hybridiseringsanalyser med enkelmolekylkänslighet utan användning av radioaktivitet. Denna metod (t.ex. ViewRNA -analyser) kan användas för att visualisera upp till fyra mål i en analys, och den använder patenterad sonddesign och bDNA -signalförstärkning för att generera känsliga och specifika signaler. Prover (celler, vävnader och CTC) fixeras och behandlas sedan för att möjliggöra åtkomst till RNA-mål (RNA-maskering). Målspecifika prober hybridiserar till varje mål-RNA. Efterföljande signalförstärkning är baserad på specifik hybridisering av intilliggande prober (individuella oligonukleotider [oligos] som binder sida vid sida på RNA -mål). En typisk målspecifik sond kommer att innehålla 40 oligonukleotider, vilket resulterar i 20 oligopar som binder sida vid sida på målet för detektion av mRNA och lncRNA och 2 oligos eller ett enda par för miRNA-detektion. Signalförstärkning uppnås via en serie sekventiella hybridiseringssteg. En förförstärkarmolekyl hybridiserar till varje oligopar på det målspecifika RNA, sedan hybridiserar flera förstärkarmolekyler till varje förförstärkare. Därefter hybridiserar multipelmärkta sondoligonukleotider (konjugerade till alkaliskt fosfatas eller direkt till fluoroforer) till varje förstärkarmolekyl. En färdigmonterad signalförstärkningsstruktur “Tree” har 400 bindningsställen för etikettproberna. När alla målspecifika prober binder till mål-mRNA-transkriptet sker en 8 000-faldig signalförstärkning för det ena transkriptet. Separata men kompatibla signalförstärkningssystem möjliggör multiplexanalyser. Signalen kan visualiseras med hjälp av ett fluorescens- eller ljusfältmikroskop.

Grundläggande steg för digoxigenin-märkta prober

  1. permeabilisering av celler med proteinas K till öppna cellmembran (cirka 25 minuter, behövs inte för vävnadssektioner eller några tidiga embryon)
  2. bindning av mRNA till markerad RNA -sond (vanligtvis över natten)
  3. antikropp-fosfatasbindning till RNA-sond (några timmar)
  4. färgning av antikropp (t.ex. med alkaliskt fosfatas )

Protokollet tar cirka 2–3 dagar och tar lite tid att konfigurera. Vissa företag säljer robotar för att automatisera processen (t.ex. Intavis InsituPro VSi ). Som ett resultat har storskaliga screenings genomförts i laboratorier på tusentals gener. Resultaten kan vanligtvis nås via webbplatser (se externa länkar).

Se även

Referenser

  1. Jin, L; Lloyd, RV (1997). "Hybridisering in situ: metoder och tillämpningar" . Journal of Clinical Laboratory Analysis . 11 (1): 2–9. doi : 10.1002/(SICI) 1098-2825 (1997) 11: 1 <2 :: AID-JCLA2> 3.0.CO; 2-F . PMC  6760707 . PMID  9021518 .
  2. Omfattande och kommenterad in situ hybridiseringshistokemi
  3. RNA -sekvensering av bukspottkörtelcirkulerande tumörceller implicerar WNT -signalering vid metastasering
  4. Den lokala transkriptomen i Synaptic Neuropil avslöjades genom djup sekvensering och högupplöst bildbehandling

externa länkar