Kollagen hybridiserande peptid - Collagen hybridizing peptide
En kollagenhybridiserande peptid ( CHP ) är en syntetisk peptidsekvens med typiskt 6 till 10 upprepande enheter av Gly-Xaa-Yaa aminosyratripletten , som härmar kännetecknet för naturliga kollagener . En kraftvärme -peptid har vanligtvis ett högt innehåll av Proline och Hydroxyproline i Xaa- och Yaa -positionerna, vilket ger den en stark benägenhet att bilda kollagens unika trippel -spiralformning . I den enkelsträngade (monomera) statusen kan peptiden känna igen denaturerade kollagensträngar i vävnader genom att bilda en hybridiserad trippelspiral med kollagensträngarna. Detta sker via den trippel spiralformade kedjesammansättningen och vätebindning mellan kedjorna, på ett sätt som liknar primers som binder till smälta DNA- strängar under PCR . Bindningen beror inte på en specifik sekvens eller epitop på kollagen, vilket gör det möjligt för kraftvärme att rikta in denaturerade kollagenkedjor av olika typer.
Kollagen, kraftvärme, CMP och CLP
Kollagen är huvudkomponenten i den extracellulära matrisen (ECM). Kollagenöverfamiljen består av 28 olika typer av kollagen. Även om funktionen och hierarkiska strukturen för dessa kollagener kan variera, delar de alla den definierande strukturella egenskapen som kallas trippelspiralen, där tre vänsterhänta polyprolin II-typ (PPII) spiraler samlas för att bilda ett högerhänt supercoiled spiralmotiv. Korta syntetiska peptider som kallas kollagenmimetiska peptider (CMP) eller kollagenliknande peptider (CLP) har spelat en viktig roll för att belysa 3D-strukturen hos kollagen trippel helix , dess vikningskinetik och termisk stabilitet som små trippel spiralformade modeller. CMP, CLP och CHP är alla mycket lika när det gäller deras aminosyrasekvenser, men endast när CMP eller CLP värms över sina smälttemperaturer, existerar de i det dissocierade, enkelsträngade tillståndet och kan betraktas som kraftvärme.
Bindningsmekanism
Ensträngade kraftvärme binder till denaturerade kollagenkedjor och gelatin på ett sätt som är unikt från andra inriktningsmekanismer, genom att de specifikt känner igen ett unikt strukturmotiv ( kollagen trippel helix ) för vikning och kedjesamling, i motsats till specifik epitopbindning som är ses för monoklonala antikroppar (mAbs), till exempel. På grund av sin unika målmekanism har kraftvärme en hög bindningsspecificitet mot denaturerade kollagenkedjor men har nästan ingen affinitet för intakt (trippel spiralformat) kollagen. Kraftvärme kan i stort sett rikta sig mot kollagenkedjor som har denaturerats genom termiska, kemiska, mekaniska eller enzymatiska processer, liksom flera kollagentyper (t.ex. Col I , II , IV ). Studier visade också att kraftvärme och deras fluoroforkonjugat har överlägsen stabilitet i kontakt med serum.
Denaturerat kollagen som en biomarkör för vävnadsmodellering och skador
Kontrollerad kollagenomsättning är avgörande för embryonal utveckling, organmorfogenes, samt vävnadsunderhåll och reparation. Ändringar av kollagen homeostas är dock associerade med många sjukdomar och patologiska tillstånd. Överdriven kollagennedbrytning kan vara associerad med cancermetastaser , hudåldring , artrit och osteoporos . Kraftvärme kan rikta in sig på vävnader som genomgår ombyggnad baserat på deras förmåga att binda till nedbrutna och utfällda kollagensträngar genom trippel helixbildning. Som en målgrupp erbjuder kraftvärme stor potential inom histopatologi , diagnostik och läkemedelsleverans för ett brett spektrum av sjukdomar.
De flesta metoder för utvärdering av kollagendenaturering i sjukdomstillstånd är indirekt, såsom att detektera matrismetalloproteinas (MMP) aktivitet eller kvantifiera kollagenpeptidfragment i urin, serum eller ledvätska . Genom att använda konventionella metoder för att direkt rikta kollagen måste forskare förlita sig på kollagenbindande peptider valda genom fagvisning , härledda från kollagenbindande proteiner eller antikroppar som bildas mot kollagener. Tyvärr kan dessa föreningar inte rikta in sig på denaturerade kollagener som är ostrukturerade och inte presenterar en definierad 3D -epitop. Dessutom kan antikroppar som rapporterades särskilja specifika nedbrutna kollagenfragment bara känna igen en eller några kollagentyper. Däremot kan kraftvärme i princip binda till alla typer av denaturerade kollagener.
Ansökningar
Vävnadsfärgning
Fluorofor- eller biotinmärkta kraftvärme används som färgämne för att detektera kollagennedbrytning och denaturering via immunfluorescens- och immunhistokemi- applikationer. Kraftvärme kan fläcka frysta vävnadssnitt , formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) sektioner samt färska vävnader. Kraftvärme är tillämpligt på vävnadsprover från flera arter och en rad sjukdomar, såsom hjärtinfarkt , artrit , nefrit och fibros .
In vivo -avbildning
Kraftvärme kan också märkas med nära-infraröda fluoroforer för in vivo fluorescerande avbildning.
Kollagenidentifiering
Kraftvärme kan användas för att visualisera många olika typer av kollagenband i SDS-PAGE- geler. Kollagen denatureras genom upphettning i närvaro av SDS innan gelén laddas. Kollagenbanden visualiseras genom kraftvärme-kollagenhybridisering när gelerna färgas av fluorescensmärkta kraftvärme.
Upptäcker mekanisk skada på bindväv
Kollagen erbjuder mekanisk styrka i bärande vävnader i kroppen som senor, ledband och ben. När krafter appliceras på dessa vävnader kan kollagen trippel helix skadas och varva ner, och kraftvärme möjliggör upptäckt av molekylär nivå av mekanisk skada i sådana bindväv.