Kemisk biologi - Chemical biology

Kemisk biologi är en vetenskaplig disciplin som spänner över kemi och biologi . Disciplinen innebär tillämpning av kemiska tekniker, analyser och ofta små molekyler som produceras genom syntetisk kemi , för att studera och manipulera biologiska system. I motsats till biokemi , som involverar studier av biomolekylernas kemi och reglering av biokemiska vägar inom och mellan celler, handlar kemisk biologi om kemi som tillämpas på biologi (syntes av biomolekyler, simulering av biologiska system etc.).

Introduktion

Vissa former av kemisk biologi försöker besvara biologiska frågor genom att studera biologiska system på kemisk nivå. Till skillnad från forskning som använder biokemi , genetik eller molekylär biologi , där mutagenes kan tillhandahålla en ny version av organismen, cellen eller biomolekylen av intresse, kemiska biologiska sonder system in vitro och in vivo med små molekyler som har utformats för en specifik syfte eller identifieras på grundval av biokemisk eller cellbaserad screening (se kemisk genetik ).

Kemisk biologi är en av flera tvärvetenskapliga vetenskaper som tenderar att skilja sig från äldre, reduktionistiska områden och vars mål är att uppnå en beskrivning av vetenskaplig holism . Kemisk biologi har vetenskapliga, historiska och filosofiska rötter inom medicinsk kemi , supramolekylär kemi , bioorganisk kemi , farmakologi , genetik , biokemi och metabolisk teknik .

System av intresse

Anrikningstekniker för proteomik

Kemiska biologer arbetar för att förbättra proteomik genom utveckling av anrikningsstrategier, kemiska affinitetstaggar och nya sonder. Prover för proteomik innehåller ofta många peptidsekvenser och sekvensen av intresse kan vara starkt representerad eller med lågt överflöd, vilket skapar en barriär för deras upptäckt. Kemiska biologiska metoder kan minska provkomplexiteten genom selektiv anrikning med hjälp av affinitetskromatografi . Detta innebär att man riktar in sig på en peptid med en särskiljande egenskap som en biotinmärkning eller en posttranslationell modifiering . Metoder har utvecklats som inkluderar användning av antikroppar, lektiner för att fånga glykoproteiner och immobiliserade metalljoner för att fånga fosforylerade peptider och enzymsubstrat för att fånga utvalda enzymer.

Enzymprober

För att undersöka enzymatisk aktivitet i motsats till totalt protein har aktivitetsbaserade reagenser utvecklats för att märka den enzymatiskt aktiva formen av proteiner (se Aktivitetsbaserad proteomik ). Till exempel har serinhydrolas- och cysteinproteashämmare omvandlats till självmordshämmare . Denna strategi förbättrar möjligheten att selektivt analysera låga överflödiga beståndsdelar genom direkt inriktning. Enzymaktivitet kan också övervakas via konverterat substrat. Identifiering av enzymsubstrat är ett problem med betydande svårigheter i proteomik och är avgörande för förståelsen av signaltransduktionsvägar i celler. En metod som har utvecklats använder "analogkänsliga" kinaser för att märka substrat med en onaturlig ATP-analog, vilket underlättar visualisering och identifiering genom ett unikt handtag.

Glykobiologi

Medan DNA , RNA och proteiner alla är kodade på genetisk nivå, kodas glykaner (sockerpolymerer) inte direkt från genomet och färre verktyg är tillgängliga för deras studie. Glykobiologi är därför ett område för aktiv forskning för kemiska biologer. Till exempel kan celler förses med syntetiska varianter av naturliga sockerarter för att undersöka deras funktion. Carolyn Bertozzis forskargrupp har utvecklat metoder för att specifikt reagera molekyler på cellytan via syntetiska sockerarter.

Kombinerande kemi

Kemiska biologer använde automatiserad syntes av olika små molekylbibliotek för att utföra analyser av biologiska processer med hög genomströmning. Sådana experiment kan leda till upptäckt av små molekyler med antibiotiska eller kemoterapeutiska egenskaper. Dessa kombinationskemiska metoder är identiska med de som används inom disciplinen farmakologi.

Anställer biologi

Många forskningsprogram är också inriktade på att använda naturliga biomolekyler för att utföra biologiska uppgifter eller för att stödja en ny kemisk metod. I detta avseende har forskare från kemisk biologi visat att DNA kan fungera som en mall för syntetisk kemi, självmonterade proteiner kan fungera som en strukturell byggnadsställning för nya material och RNA kan utvecklas in vitro för att producera ny katalytisk funktion. Dessutom, heterobifunktionella (dubbelsidiga) syntetiska små molekyler, såsom dimerisatorer eller PROTAC, för samman två proteiner inuti celler, vilket syntetiskt kan framkalla viktiga nya biologiska funktioner, såsom riktad proteinnedbrytning.

Peptidsyntes

Kemisk syntes av proteiner är ett värdefullt verktyg inom kemisk biologi eftersom det möjliggör införande av icke-naturliga aminosyror samt restspecifik införlivande av " posttranslational modifikationer " såsom fosforylering, glykosylering, acetylering och till och med ubiquitination . Dessa förmågor är värdefulla för kemiska biologer eftersom icke-naturliga aminosyror kan användas för att sondera och ändra proteinets funktionalitet, medan modifieringar efter translation är allmänt kända för att reglera strukturen och aktiviteten hos proteiner. Även om strikt biologiska tekniker har utvecklats för att uppnå dessa ändamål, har den kemiska syntesen av peptider ofta en lägre teknisk och praktisk barriär för att erhålla små mängder av det önskade proteinet.

För att göra polypeptidkedjor i proteinstorlek via de små peptidfragmenten som tillverkas genom syntes, använder kemiska biologer processen för nativ kemisk ligering . Ursprunglig kemisk ligering innefattar koppling av en C-terminal tioester och en N-terminal cysteinrest, vilket slutligen resulterar i bildning av en "nativ" amidbindning. Andra strategier som har använts för ligering av peptidfragment med användning av acylöverföringskemin som först introducerades med nativ kemisk ligering inkluderar uttryckt proteinligering, sulfurisering/avsvavlingsteknik och användning av avtagbara tiolhjälpmedel. Uttryckt proteinligering möjliggör bioteknologisk installation av en C-terminal tioester med hjälp av inteiner , vilket möjliggör tillägg av en syntetisk N-terminal peptid till den rekombinant producerade C-terminala delen. Både sulfuriserings-/avsvavlingstekniker och användningen av avtagbara tiolhjälpmedel innefattar installation av en syntetisk tiolgrupp för att utföra standard nativ kemisk ligeringskemi, följt av avlägsnande av hjälpmedlet/tiolen.

Riktade evolutionen

Ett primärt mål för proteinteknik är utformningen av nya peptider eller proteiner med en önskad struktur och kemisk aktivitet. Eftersom vår kunskap om förhållandet mellan primär sekvens, struktur och funktion hos proteiner är begränsad, är rationell design av nya proteiner med konstruerade aktiviteter extremt utmanande. I riktad utveckling kan upprepade cykler av genetisk diversifiering följt av en screening- eller urvalsprocess användas för att efterlikna naturligt urval i laboratoriet för att designa nya proteiner med önskad aktivitet.

Det finns flera metoder för att skapa stora bibliotek med sekvensvarianter. Bland de mest använda är att utsätta DNA för UV-strålning eller kemiska mutagener , felbenägen PCR , degenererade kodoner eller rekombination . När väl ett stort varianterbibliotek skapats används urvals- eller screeningtekniker för att hitta mutanter med ett önskat attribut. Vanliga urvals-/screeningtekniker inkluderar FACS , mRNA -display , fagdisplay och in vitro -avdelning . När väl användbara varianter hittats amplifieras deras DNA -sekvens och utsätts för ytterligare omgångar med diversifiering och selektion.

Utvecklingen av riktade utvecklingsmetoder hedrades 2018 med Nobelpriset i kemi till Frances Arnold för utveckling av enzymer, och George Smith och Gregory Winter för fagvisning.

Bioortogonala reaktioner

Framgångsrik märkning av en molekyl av intresse kräver specifik funktionalisering av den molekylen för att reagera kemospecifikt med en optisk sond. För att ett märkningsexperiment ska anses vara robust måste den funktionaliseringen minimera systemet. Tyvärr är dessa krav ofta svåra att uppfylla. Många av de reaktioner som normalt är tillgängliga för organiska kemister i laboratoriet är inte tillgängliga i levande system. Vatten- och redoxkänsliga reaktioner skulle inte fortsätta, reagenser som är benägna att nukleofila attacker skulle inte erbjuda någon kemospecificitet, och alla reaktioner med stora kinetiska barriärer skulle inte hitta tillräckligt med energi i den relativt låga värmemiljön i en levande cell. Således har kemister nyligen utvecklat en panel för bioortogonal kemi som fortskrider kemospecifikt, trots miljön av distraherande reaktiva material in vivo .

Kopplingen av en sond till en molekyl av intresse måste ske inom en rimligt kort tidsram; därför bör kinetiken för kopplingsreaktionen vara mycket gynnsam. Klickkemi är väl lämpad för att fylla denna nisch, eftersom klickreaktioner är snabba, spontana, selektiva och högavkastande. Tyvärr är den mest kända "klickreaktionen", en [3+2] cykloaddition mellan en azid och en acyklisk alkyn , kopparkatalyserad, vilket utgör ett allvarligt problem för användning in vivo på grund av koppars toxicitet. För att kringgå nödvändigheten av en katalysator introducerade Carolyn R. Bertozzis laboratorium inneboende stam i alkynarten genom att använda en cyklisk alkyn. I synnerhet, cyclooctyne reagerar med azido-molekyler med distinkta kraft.

Den vanligaste metoden för att installera bioortogonal reaktivitet i en målbiomolekyl är genom metabolisk märkning. Celler är nedsänkta i ett medium där tillgången till näringsämnen är begränsad till syntetiskt modifierade analoger av standardbränslen som sockerarter. Som en konsekvens införlivas dessa förändrade biomolekyler i cellerna på samma sätt som de omodifierade metaboliterna. En sond inkorporeras sedan i systemet för att avbilda ödet för de förändrade biomolekylerna. Andra metoder för funktionalisering inkluderar enzymatisk insättning av azider i proteiner och syntetisering av fosfolipider konjugerade till cyklooktyner.

Upptäckt av biomolekyler genom metagenomik

Framstegen inom modern sekvenseringsteknik i slutet av 1990 -talet gjorde det möjligt för forskare att undersöka DNA från grupper av organismer i deras naturliga miljöer ("eDNA"), utan att odla enskilda arter i labbet. Detta metagenomiska tillvägagångssätt gjorde det möjligt för forskare att studera ett brett urval av organismer som tidigare inte karakteriserades på grund av delvis inkompetent tillväxtförhållande. Källor till eDNA inkluderar jordar , hav, underjorden , varma källor , hydrotermiska ventiler , polära iskappar , hypersalinmiljöer och extrema pH -miljöer. Av de många tillämpningarna av metagenomik undersökte forskare som Jo Handelsman , Jon Clardy och Robert M. Goodman metagenomiska metoder för upptäckten av biologiskt aktiva molekyler som antibiotika .

Översikt över metagenomiska metoder
Översikt över metagenomiska metoder

Funktionella eller homologiska screeningstrategier har använts för att identifiera gener som producerar små bioaktiva molekyler. Funktionella metagenomiska studier är utformade för att söka efter specifika fenotyper som är associerade med molekyler med specifika egenskaper. Homologiska metagenomiska studier, å andra sidan, är utformade för att undersöka gener för att identifiera bevarade sekvenser som tidigare är associerade med uttrycket av biologiskt aktiva molekyler.

Funktionella metagenomiska studier möjliggör upptäckt av nya gener som kodar för biologiskt aktiva molekyler. Dessa analyser inkluderar toppagaröverlagringsanalyser där antibiotika genererar tillväxtinhiberingszoner mot testmikrober och pH -analyser som kan screena för pH -förändring på grund av nysyntetiserade molekyler med hjälp av pH -indikator på en agarplatta . Substratinducerad genuttrycksscreening (SIGEX), en metod för att screena för uttryck av gener som induceras av kemiska föreningar, har också använts för att söka efter gener med specifika funktioner. Homologibaserade metagenomiska studier har lett till en snabb upptäckt av gener som har homologa sekvenser som de tidigare kända generna som är ansvariga för biosyntesen av biologiskt aktiva molekyler. Så snart generna sekvenseras kan forskare jämföra tusentals bakteriella genom samtidigt. Fördelen jämfört med funktionella metagenomiska analyser är att homologiska metagenomiska studier inte kräver ett värdorganismsystem för att uttrycka metagenomen, så denna metod kan potentiellt spara tid åt analys av icke -funktionella genomer. Dessa ledde också till upptäckten av flera nya proteiner och små molekyler. Dessutom fann en in silico -undersökning från Global Ocean Metagenomic Survey 20 nya lantibiotiska cykler.

Kinaser

Posttranslational modifiering av proteiner med fosfatgrupper genom kinaser är ett viktigt reglerande steg i alla biologiska system. Fosforyleringshändelser, antingen fosforylering med proteinkinaser eller defosforylering av fosfataser , resulterar i proteinaktivering eller avaktivering. Dessa händelser har en inverkan på regleringen av fysiologiska vägar, vilket gör förmågan att dissekera och studera dessa vägar integrerad för att förstå detaljerna i cellulära processer. Det finns ett antal utmaningar - nämligen fosfoproteomets stora storlek, fosforyleringshändelsernas flyktiga natur och relaterade fysiska begränsningar av klassiska biologiska och biokemiska tekniker - som har begränsat kunskapsutvecklingen inom detta område.

Genom användning av små molekylmodulatorer av proteinkinaser har kemiska biologer fått en bättre förståelse för effekterna av proteinfosforylering. Till exempel är icke -selektiva och selektiva kinashämmare, såsom en klass av pyridinylimidazolföreningar, potenta hämmare användbara vid dissektion av MAP -kinas -signalvägar. Dessa pyridinylimidazolföreningar fungerar genom att rikta in sig på ATP -bindningsfickan. Även om detta tillvägagångssätt, liksom relaterade tillvägagångssätt, med små modifieringar, har visat sig effektivt i ett antal fall, saknar dessa föreningar tillräcklig specificitet för mer allmänna tillämpningar. En annan klass av föreningar, mekanismbaserade hämmare, kombinerar kunskap om kinasenzymologi med tidigare använda hämmningsmotiv. Exempelvis inhiberar en "bisubstratanalog" kinasverkan genom att binda både den konserverade ATP -bindningsfickan och ett protein/peptidigenkänningsställe på det specifika kinaset. Forskargrupper använde också ATP -analoger som kemiska sonder för att studera kinaser och identifiera deras substrat.

Utvecklingen av nya kemiska medel för att införliva fosfomimetiska aminosyror i proteiner har gett viktig inblick i effekterna av fosforyleringshändelser. Fosforyleringshändelser har typiskt studerats genom att mutera ett identifierat fosforyleringsställe ( serin , treonin eller tyrosin ) till en aminosyra, såsom alanin , som inte kan fosforyleras. Dessa tekniker har dock begränsningar och kemiska biologer har utvecklat förbättrade sätt att undersöka proteinfosforylering. Genom att installera fosfo-serin, fosfo-treonin eller analogt fosfonat efterliknar inbyggda proteiner kan forskare utföra in vivo-studier för att undersöka effekterna av fosforylering genom att förlänga tiden en fosforyleringshändelse inträffar samtidigt som de ofta ogynnsamma effekterna av mutationer minimeras. . Uttryckt proteinligering har visat sig vara framgångsrika tekniker för syntetiskt framställning av proteiner som innehåller fosfomimetiska molekyler vid endera änden. Dessutom har forskare använt onaturlig aminosyramutagenes på riktade platser inom en peptidsekvens.

Framsteg inom kemisk biologi har också förbättrats med klassiska tekniker för avbildning av kinasverkan. Till exempel förbättrade utvecklingen av peptidbiosensorer — peptider innehållande införlivade fluoroforer tidsupplösning av in vitro -bindningsanalyser. En av de mest användbara teknikerna för att studera kinasverkan är Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) . För att använda FRET för fosforyleringsstudier kopplas fluorescerande proteiner till både en fosfoaminosyrabindande domän och en peptid som kan fosforyleras. Vid fosforylering eller defosforylering av en substratpeptid sker en konformationsförändring som resulterar i en förändring i fluorescens. FRET har också använts parallellt med Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) eller fluorescent konjugerade antikroppar och flödescytometri för att ge kvantitativa resultat med utmärkt tids- och rumslig upplösning.

Biologisk fluorescens

Kemiska biologer studerar ofta biologiska makromolekylers funktioner med hjälp av fluorescenstekniker . Fördelen med fluorescens kontra andra tekniker ligger i dess höga känslighet, icke-invasivitet, säker detektering och förmåga att modulera fluorescenssignalen. Under de senaste åren har upptäckten av grönt fluorescerande protein (GFP) av Roger Y. Tsien och andra, hybridsystem och kvantpunkter gjort det möjligt att bedöma proteinets placering och funktion mer exakt. Tre huvudtyper av fluoroforer används: små organiska färgämnen, gröna fluorescerande proteiner och kvantprickar . Små organiska färgämnen är vanligtvis mindre än 1 kDa och har modifierats för att öka fotostabilitet och ljusstyrka och minska självkylning. Kvantprickar har mycket skarpa våglängder, hög molarabsorptivitet och kvantutbyte. Både organiska färgämnen och kvantfärgämnen har inte förmågan att känna igen proteinet av intresse utan hjälp av antikroppar, därför måste de använda immunmärkning . Fluorescerande proteiner är genetiskt kodade och kan smälta ihop med ditt protein av intresse. En annan genetisk märkningsteknik är tetracystein-biarseniska systemet, som kräver modifiering av den riktade sekvensen som inkluderar fyra cystein, som binder membrangenomsläppliga biarseniska molekyler, de gröna och de röda färgämnena "FlAsH" och "ReAsH", med picomolär affinitet. Både fluorescerande proteiner och biarseniskt tetracystein kan uttryckas i levande celler, men har stora begränsningar i ektopiskt uttryck och kan orsaka förlust av funktion.

Fluorescerande tekniker har använts för att bedöma ett antal proteindynamika, inklusive proteinspårning, konformationsförändringar, protein -protein -interaktioner, proteinsyntes och omsättning, och enzymaktivitet, bland andra. Tre allmänna tillvägagångssätt för mätning av proteinets nettodistribution och -diffusion är enpartikelspårning, korrelationsspektroskopi och fotomärkningsmetoder. Vid enpartikelspårning måste den enskilda molekylen vara både ljus och gles nog för att spåras från en video till den andra. Korrelationsspektroskopi analyserar intensitetsfluktuationer som härrör från migrering av fluorescerande objekt till och från en liten volym i fokus för en laser. Vid fotomärkning kan ett fluorescerande protein släckas i ett subcellulärt område med hjälp av intensiv lokal belysning och den markerade molekylens öde kan avbildas direkt. Michalet och medarbetare använde kvantprickar för spårning av en enda partikel med hjälp av biotin-kvantprickar i HeLa-celler. Ett av de bästa sätten att upptäcka konformationsförändringar i proteiner är att märka proteinet av intresse med två fluoroforer i närheten. FRET kommer att svara på interna konformationsförändringar som är resultatet av omorientering av en fluorofor med avseende på den andra. Man kan också använda fluorescens för att visualisera enzymaktivitet, vanligtvis genom att använda en släckt aktivitetsbaserad proteomik (qABP). Kovalent bindning av en qABP till det aktiva stället för det riktade enzymet kommer att ge direkta bevis på om enzymet är ansvarigt för signalen vid släppning av släckaren och återfå fluorescens.

Se även

Referenser

Vidare läsning

Tidskrifter

  • ACS Chemical Biology - Den nya tidskriften Chemical Biology från American Chemical Society.
  • Bioorganisk och medicinsk kemi - The Tetrahedron Journal for Research at the Interface of Chemistry and Biology
  • ChemBioChem - A European Journal of Chemical Biology
  • Kemisk biologi - En åtkomstpunkt för kemisk biologi nyheter och forskning från hela RSC Publishing
  • Cell Chemical Biology - En tvärvetenskaplig tidskrift som publicerar artiklar av exceptionellt intresse inom alla områden i gränssnittet mellan kemi och biologi. chembiol.com
  • Journal of Chemical Biology - En ny tidskrift som publicerar nytt arbete och recensioner på gränssnittet mellan biologi och fysik, publicerad av Springer. länk
  • Journal of the Royal Society Interface- En tvärvetenskaplig publikation som främjar forskning i gränssnittet mellan fysik och biovetenskap
  • Molecular BioSystems -Kemisk biologitidskrift med särskilt fokus på gränssnittet mellan kemi och -omiska vetenskaper och systembiologi.
  • Nature Chemical Biology - En månatlig tvärvetenskaplig tidskrift som ger ett internationellt forum för snabb publicering av betydande ny forskning i gränssnittet mellan kemi och biologi.
  • Wiley Encyclopedia of Chemical Biology länk