Jäst assimilerbart kväve - Yeast assimilable nitrogen
Jäst assimilerbart kväve eller YAN är kombinationen av fria aminokväve (FAN), ammoniak (NH 3 ) och ammonium (NH 4 + ) som är tillgänglig för den vinjäst Saccharomyces cerevisiae till användning under jäsning . Utanför det fermenterbara sockret glukos och fruktos är kväve det viktigaste näringsämnet som behövs för att genomföra en framgångsrik jäsning som inte slutar före den avsedda torrpunkten eller ser utvecklingen av lukt och relaterade vinfel . I denna utsträckning kommer vinproducenter ofta att komplettera de tillgängliga YAN-resurserna med kvävetillsatser som diammoniumfosfat (DAP).
Tillsatsen av alltför stora mängder kväve kan emellertid också skapa en fara eftersom andra organismer förutom nyttigt vinjäst kan använda näringsämnena. Dessa inkluderar förstöringsorganismer såsom Brettanomyces , Acetobacter och mjölksyrabakterier från släktena Lactobacillus och Pediococcus . Det är därför många vingårdar kommer att mäta YAN efter skörd och krossning med hjälp av en av flera metoder som finns idag, inklusive kväve genom o-ftalaldialdehydanalys (NOPA) som kräver användning av en spektrometer eller Formol-titreringsmetoden . Att känna till YAN i mustet gör det möjligt för vinproducenter att beräkna rätt mängd tillsats som behövs för att komma igenom jäsning, och lämnar bara "näringsämnen" för eventuella förstöringsorganismer som kommer efteråt.
Mängden Yan att vinproducenter kommer att se i sina druvmust beror på ett antal komponenter, inklusive druvsort , rotstock , vingård jordar och vinodlings metoder (t.ex. användning av gödningsmedel och canopy management ) samt klimatförhållandena speciella årgångar .
Komponenter
YAN är ett mått på de primära organiska (fria aminosyrorna) och oorganiska (ammoniak och ammonium) kvävekällor som kan assimileras av S. cerevisiae . Det finns flera kväveföreningar som finns i must och vin, inklusive peptider , större proteiner , amider , biogena aminer , pyridiner , puriner och nukleinsyror men dessa kan inte användas direkt av jäst för metabolism. Sammantaget kan den totala kvävehalten i druvmust vara mellan 60 och 2400 mg kväve per liter, men inte allt detta kväve kan assimileras. Bristen på proteasenzymer , som bryter ner större peptider i mindre komponenter, som kan arbeta utanför cellen, begränsar storleken på de molekyler som jäst kan använda som kvävekälla.
Mängden YAN som vinmakare kommer att se i sina druvmust beror på ett antal komponenter inklusive druvsort, rotstam, vingårdsmark och vinodlingsmetoder (såsom användning av gödselmedel och kapellhantering) samt klimatförhållandena för vissa årgångar. Infektioner med mögel, såsom Botrytis cinerea (känd som ädelrutt när det är önskvärt) kan minska aminosyrahalten i druvmust med så mycket som 61%. Vissa regioner är kända för att ha låg YAN som Washington State som under en typisk årgång kommer att ha 90% av testade must måste under 400 mg N / L och nästan en fjärdedel vara under 150 mg N / L.
I vingården tas kväve upp av vinrankan som nitrat (NO 3 - ), ammonium eller urea som reduceras till ammoniak. Genom ytterligare reaktioner införlivas kvävet i glutamin och glutamat och används så småningom vid syntes av andra aminosyror och kväveföreningar. Efter skörden koncentreras majoriteten (cirka 80%) av tillgängliga kvävehaltiga föreningar i druvorna i skinn och frön. Dessa föreningar släpps ut i mustet under krossningsprocessen och under maceration / hudkontakt. Även efter pressning upp till 80% av den ursprungliga kvävehalten i varje druvbär kommer att lämnas kvar i presskroppen .
Aminosyror
Av det fria aminokvävet (FAN) som utgör YAN är aminosyrorna arginin , prolin och glutamin de mest förekommande följt av alanin , treonin , serin och asparaginsyra i mycket mindre koncentrationer men spårmängder av mest kända aminosyror kan hittas i druvmust. Proline är vanligtvis den mest koncentrerade och kan representera upp till 30% av den totala mängden aminosyror. Den exakta mängden FAN varierar och kan sträcka sig från 22 till 1242 mg kväve / liter YAN som härrör från fria aminosyror.
Medan arginin, glutamin och andra aminosyror snabbt konsumeras ofta mycket tidigt under jäsning, konsumeras inte prolin alls av jäst under de normala, anaeroba betingelserna för jäsning. Detta beror på att ett av de enzymer som krävs för dess användning är ett oxidas (som kräver molekylärt syre) och det andra undertrycks av närvaron av ammonium (en annan källa till assimilerbart kväve som behövs av jäst) i mustet. Väl luftade startkulturer som innehåller must som inte har fått något diammoniumfosfat tillsatt det kommer vanligtvis att se en del användning av prolin innan de anaeroba förhållandena för jäsning sparkar in. När vinproducenter mäter FAN måste de vara medvetna om deras analys inkluderar prolin eftersom detta kommer att göra deras YAN-mätning högre. Chardonnay och Cabernet Sauvignon är två Vitis vinifera- sorter som är kända för att ha mycket höga prolinnivåer medan Riesling och Sauvignon blanc vanligtvis har mycket låga nivåer.
Jästtransport aminosyror och små peptider (mindre än 5 aminosyrarester ) in i cellen via en aktiv transportprocess som använder specialiserade membranproteiner och skillnaden i pH- gradienten för den sura vinlösningen (pH mellan 3-4) och den nära neutralt pH för cytoplasma inuti jästcellerna. De proton symport proteiner i membran take i aminosyra kopplas med en vätejon som senare blir utvisas av cellen via en vätejon pump . Detta är en energiberoende process som blir mer energiskt ogynnsam för jästcellen när jäsning fortskred och etanolnivåerna ökar, vilket skapar "passivt läckage" av överskott av vätejoner i cellen. Cellens vätejonpumpar måste arbeta ännu hårdare för att bibehålla sitt inre pH så att det skickar en signal till symportproteinerna för att sluta ta med andra joner. Detta är en av anledningarna till att kvävertillsatser med sen fermentering har liten eller ingen effektiv effekt eftersom transportmekanismerna för kvävet in i cellen stängs av.
Ammoniakföreningar
Under jäsning är ammonium den primära formen av assimilerbart kväve tillgängligt för jäst. Vid krossning kan juicen emellertid innehålla allt från 0 till 150 mg / L ammoniumsalter, beroende på hur mycket kväve vinrankan fick i vingården.
I cellen "fixeras" oorganiska ammoniak- och ammoniumjoner genom en serie kemiska reaktioner som i slutändan ger den organiska kvävekällan glutamat. Ammoniumjonen fungerar också som en allosterisk regulator för ett av de enzymer som används vid glykolys och kan också ha en effekt på hur jästcellen transporterar glukos och fruktos in i cellen. Proteinerna som används i huvudglukostransportsystemet har visat sig ha en halveringstid på 12 timmar. I studierna som sätter jästceller genom "ammoniak svält" stängs hela systemet av efter 50 timmar vilket ger starka bevis för att brist på ammoniak / ammonium kan skapa ökad risk för fasta jäsning.
Glutation (GSH: L-gamma-glutamyl-L-cysteinylglycin) förekommer i höga koncentrationer upp till 10 mM i jästceller. Den antar en avgörande roll som svar på svavel och kväve.
Ammoniak används inte av bakterier som Acetobacter och mjölksyrabakterierna som används vid malolaktisk jäsning .
Betydelsen av vinframställning
Assimilerbart kväve är ett väsentligt näringsämne som behövs av vinjäst för att fullborda jäsning med en minimal mängd oönskade biprodukter (såsom föreningar som vätesulfid som kan skapa lukt). Under en jäsning kan jäst använda upp till 1000 mg / l aminosyror, men ofta är det mycket mindre än vad som krävs. Jäst kan lagra aminosyror i intracellulära vakuoler och sedan senare antingen använda dem direkt, införliva dem i proteiner eller bryta ner dem och använda deras kol- och kvävekomponenter separat.
I frånvaro av kväve börjar jäst att stängas av och dö av. Vissa stammar kommer att börja bryta ner svavelinnehållande aminosyror som cystein och metionin som frigör en svavelatom som kan kombineras med väte för att producera vätesulfid ( H
2 S ) som kan ge ruttet ägglukt till vinet. Emellertid, finns det inte en direkt korrelation mellan YAN nivåer och vätesulfid produktion sedan H 2 S kan framställas genom jäst även i närvaro av rikliga kväve men med i stället andra viktiga näringsämnen (såsom vitamin pantotensyra ) saknas. Det finns även vissa stammar av S. cerevisiae som producerar H 2 S som ett svar på att ha för mycket tillgängligt kväve (i synnerhet för mycket glutaminsyra och alanin). Det är därför en profylaktisk strategi av urskillningslöst sätta kväve tillskott till varje fermentation inte kan ha de önskade resultaten att förhindra H 2 S.
Kvävehalterna i vinet kan påverka många sensoriska aspekter av det resulterande vinet, inklusive syntesen av många aromatiska föreningar. Fuselalkoholer framställs genom nedbrytning av aminosyror men i närvaro av höga nivåer av ammoniak och urea minskar deras produktion. När tillgängligt kväve är begränsat är halterna av glycerol och trehalos , som kan påverka munkänslan , högre.
Uppskattningar av hur mycket som behövs
Mängden YAN som behövs beror på vad vinmakarens mål är för jäsning, särskilt om vildjäsning önskas eller inte eller om vinet jäses helt till torrhet. Druvornas tillstånd och jäsningsförhållandena kommer att påverka mängden kväve som behövs. Frukt som är skadad, möglig eller botrytiserad kommer vanligtvis att tömmas mer av kväve (liksom andra vitaminresurser) när de kommer in från vingården än rena, intakta druvor. Denna utarmning kan förvärras ytterligare genom överklaring av must och hög sockerhalt. Vin som fermenteras vid högre temperaturer tenderar att utvecklas snabbare och kräver mer kväve än längre, svalare jäsning. Mängden syrexponering kommer också att påverka kväveupptagningen av jästen med vin jäst under fullständiga anaeroba förhållanden (såsom många vita viner i rostfria tankar) som kräver mindre kväve än viner jästa i fat eller fermentorer med öppen topp.
Det föreslagna intervallet som ges av enologer varierar från 150 mg / l YAN till 400 mg kväve per liter. Vissa studier har visat att maximala fermenteringshastigheter kan uppnås med YAN i intervallet 400 till 500 mg N / L. Men inte alla vinproducenter vill ha en jäsning med maximal hastighet (när det gäller jästbiomassa, temperatur och hastighet) på grund av den inverkan som den kan ha på andra sensoriska aspekter av vinet, såsom aromutveckling och fruktretention.
En studie från UC Davis Institutionen för vinodling och Enology fann att rekommendationer om optimala kvävehalter att slutföra en framgångsrik jäsning kan göras baserat skörden brix nivå som har antagits av många jäst och näringsämnen tillverkare.
- 21 ° Bx = 200 mg N / L
- 23 ° Bx = 250 mg N / L
- 25 ° Bx = 300 mg N / L
- 27 ° Bx = 350 mg N / L
Andra studier har dock visat att framgångsrik jäsning utförs med YAN-nivåer under dessa rekommendationer såväl som tröga / fasta fermentationer som inträffar även när YAN-nivåer är i linje med rekommendationerna.
Vid malolaktisk jäsning
Liksom jäst kräver mjölksyrabakterierna (LAB) som används vid malolaktisk jäsning (vanligtvis Oenococcus oeni ) kväve. Till skillnad från S. cerevisiae kan LAB emellertid inte använda ammoniak och sådana tillsatser som diammoniumfosfat (DAP) ger inga näringsmässiga fördelar. Vinproducenter som oavsiktligt använder DAP som näringstillsats för sin MLF-inokulation riskerar att ge näringsämnen istället för förstöringsorganismer som Brettanomyces .
Medan vissa vinproducenter inymmer sin LAB med näringsämnen som innehåller kväve, kommer de flesta näringsämnen som behövs för MLF från nedbrytning (eller autolys ) av de döda jästcellerna. Dessutom har de flesta bakterier som används i MLF förmågan att producera extracellulära proteasenzymer som också kan bryta ner större peptidkedjor i sina basaminosyrarester som sedan kan användas för metabolism.
Mätningar och tester
Kväve med o-ftalaldialdehydanalys (NOPA) används för att mäta tillgängliga primära aminosyror i druvsaft med en spektrofotometer som kan mäta vid 335 nm våglängder . Eftersom analysen endast mäter primära aminosyror, kommer resultaten som produceras inte att inkludera prolin- eller ammoniakkoncentrationer. Prolin kan mätas separat med en analys som använder ninhydrin för att reagera med aminosyran i närvaro av myrsyra , vilket ger en förening som kan absorberas vid 517 nm.
Formoltitrering , som uppfanns av den danska kemisten SPL Sørensen 1907, använder formaldehyd i närvaro av kalium eller natriumhydroxid för att mäta aminosyrakoncentration och ammoniak med hjälp av en pH-mätare . Reagensen reagerar också med prolin, vilket kan ge en något högre YAN-mätning än NOPA. Den formella metoden har också nackdelarna med att involvera användning och bortskaffande av formaldehyd, som är ett känt cancerframkallande ämne och det mycket toxiska reagenset bariumklorid .
Ammoniak och ammonium kan mätas med en jonselektiv elektrodprob och en pH-mätare.
Kvävetillskott
Vinproducenter har länge känt att vissa jäsning sprang mer förutsägbart och "hälsosammare" om pomace (de fasta skinnen, frön och kvarblir kvar efter pressning ) från ett annat vin tillsattes till satsen. Detta är en metod som fortfarande används idag för att göra det italienska vinet Ripasso . I 14: e århundradet Toscana , tekniken med governo som används i några av de tidigaste Chiantis inblandade lägga torkade druvor till satsen. Medan det också tillsatt socker gav båda metoderna extra kväve och andra näringsämnen som fortfarande finns i skinn och frön.
När enologer började bättre förstå vetenskapen om jäsning identifierades kväve som ett huvudnäringsämne och vinproducenter började tillsätta ammoniumsalter till sitt must redan på 1900-talet. Urea användes också som ett tidigt kvävetillskott, men forskning som kopplade det till utvecklingen av etylkarbamat har lett till förbud i många länder, inklusive USA sedan 1990.
Det finns många typer av kvävetillskott för vinproducenter att använda. De flesta av dem är komplexa formuleringar som innehåller kväve (från antingen aminosyror eller ammoniumsalter) tillsammans med vitaminer, mineraler och andra tillväxtfaktorer och säljs under varumärken som Go-Ferm , Superfood , Fermaid K (de senare två innehåller också en del DAP) . Aminosyror kan tillsättas direkt till mustet men från och med 2010 tillåts endast glycin att tillsättas till must i USA.
Jästskal (eller jästspöken) är resterna av jästcellväggar som är kvar från den kommersiella produktionen av jäststammar som ska användas för ympning. Förutom att tillhandahålla en källa för assimilerbart kväve från aminosyror, tillhandahåller de också lipider och steroler som kan användas av cellerna för att stärka deras plasmamembran, vilket möjliggör upptag av andra kvävekällor.
Risk för att lägga till för mycket
Kvävetillskott, särskilt DAP, stimulerar jästreproduktion och kan öka biomassan kraftigt. Detta kan ha en konsekvens av att påskynda jäsningshastigheten snabbare än vad en vinmakare kan önska och kommer också att öka jäsningstemperaturen på grund av värmen som alstras av jästen. Överskottet av biomassa kan också skapa brist på andra jästnäringsämnen, såsom vitaminer och steroler, på grund av ökad konkurrens och kan leda till produktion av lukt (såsom vätesulfid) och till och med fasta jäsning.
För höga nivåer av aminosyran arginin (större än 400 mg / l), särskilt nära slutet av jäsning, kan utgöra en risk att öka produktionen av etylkarbamat. Detta beror på att arginin bryts ner i urea som kan återabsorberas och användas av jäst eller metaboliseras till ammoniak. Emellertid urea reagerar också med etanol om det inte är fullständigt metaboliseras som tillsammans med långtidsexponering (såväl som höga temperaturer) kan leda till produktion av estern etyl karbamat.
Den största risken med övertillskott av ett måste är dock att överskott av kväve och andra näringsämnen kommer att finnas kvar efter att jäsning är klar. Detta kan skapa mikrobiell instabilitet eftersom förstöringsorganismer kan använda dessa överskott av näringsämnen.
Vinlagar och regler
I USA begränsar skatte- och handelsbyrån för alkohol och tobak (TTB) användningen av diammoniumfosfat som kväveadditiv till 968 mg / l (8 lbs / 1000 gal) vilket ger 203 mg N / L YAN. I Europeiska unionen följer de flesta länder riktlinjerna från International Organization of Vine and Wine (OIV) som dikterar en gräns på 300 mg / L. I Australien baseras gränsen på nivån av oorganiskt fosfat med en maximal gräns på 400 mg / l fosfat.
Påverkan av timing
Eftersom de flesta näringstillskott matar all levande mikroorganism i musten (oavsett om det är önskvärt eller inte), kommer vinproducenter ofta att vänta med att tillsätta näringsämnena tills de är redo att ympa mustet med sin önskade S. cerevisiae- stam. Producenter som använder vilda fermenter kan också vänta tills efter att svaveldioxidtillägg har dödat oönskade mikrober eller matats tidigt eftersom de vill ha den potentiella komplexitet som andra mikrober kan lägga till vinet. När det tillsätts är kvävet vanligtvis i form av aminosyror, kombinerat med vitaminer och mineraler för att få igång jäsning.
Strax efter inokuleringen börjar jäst snabbt konsumera det tillgängliga assimilerbara kvävet, med upp till 46% av YAN som helt konsumeras av full fermentering. Eftersom oorganiskt kväve, såsom ammoniumsalter i DAP, är giftigt för jäst i höga nivåer, tillsätts det aldrig under ympning när biomassan för den nyligen återhydrerade jästen är låg. Många vinproducenter delar upp dosen av DAP med den första tillsatsen som görs i slutet av eftersläpningsfasen när jästen går in i sin period av exponentiell tillväxt och alkoholjäsning börjar. I de flesta måste detta vara cirka 48 till 72 timmar efter ympning. En andra dos läggs sedan ofta till ungefär en tredjedel av sockerfermenteringen och ofta innan sockernivåerna träffar 12-10 Brix (6,5 till 5,5 Baumé, 48,3 till 40,0 Oechsle) eftersom jästcellerna inte längre kan ta kvävet in i cellen på grund av den ökande toxiciteten hos etanol som omger cellerna. Detta lämnar kvävet oanvänt och tillgängligt för förstöringsorganismer som kan komma efteråt.