Hoechst fläck - Hoechst stain
Hoechst-fläckar är en del av en familj av blå fluorescerande färgämnen som används för att fläcka DNA . Dessa Bis-bensimider utvecklades ursprungligen av Hoechst AG , som numrerade alla deras föreningar så att färgämnet Hoechst 33342 är den 33 342 förening som tillverkas av företaget. Det finns tre relaterade Hoechst-fläckar: Hoechst 33258, Hoechst 33342 och Hoechst 34580. Färgämnena Hoechst 33258 och Hoechst 33342 är de som oftast används och de har liknande excitation - emissionsspektra .
Molekylära egenskaper
Båda färgämnena exciteras av ultraviolett ljus vid cirka 350 nm , och båda avger blå-cyan fluorescerande ljus runt ett emissionsspektrummaximum vid 461 nm. Obundet färgämne har sin maximala fluorescensemission i intervallet 510–540 nm. Hoechst-fläckar kan upphetsas med en xenon- eller kvicksilverbågslampa eller med en ultraviolett laser . Det finns en avsevärd Stokes-förskjutning mellan exciterings- och emissionsspektra som gör Hoechst-färgämnen användbara i experiment där flera fluoroforer används. Fluorescensintensiteten hos Hoechst färgämnen också ökar med pH hos lösningsmedlet .
Hoechst-färgämnen är lösliga i vatten och i organiska lösningsmedel såsom dimetylformamid eller dimetylsulfoxid . Koncentrationer kan uppnås på upp till 10 mg / ml. Vattenlösningar är stabila vid 2–6 ° C i minst sex månader när de skyddas mot ljus. För långvarig förvaring fryses lösningarna istället vid -20 ° C eller lägre.
Färgämnena binder till det mindre spåret av dubbelsträngat DNA med en preferens för sekvenser rika på adenin och tymin . Även om färgämnena kan bindas till alla nukleinsyror förbättrar AT-rika dubbelsträngade DNA-strängar fluorescensen avsevärt. Hoechst färgämnen är cell- permeabla och kan binda till DNA i levande eller fixerade celler . Således kallas dessa fläckar ofta supravital , vilket betyder att levande celler överlever en behandling med dessa föreningar. Celler som uttrycker specifika ATP-bindande kassett transportören proteiner kan också aktivt transportera dessa fläckar ur sin cytoplasma .
Applikationer
En koncentration på 0,1–12 μg / ml används vanligtvis för att fläcka DNA i bakterier eller eukaryotceller . Celler färgas under 1-30 minuter vid rumstemperatur eller 37 ° C och tvättas sedan för att avlägsna obundet färgämne. En grön fluorescens av obundet Hoechst-färgämne kan observeras på prover som färgas med för mycket färgämne eller som tvättas delvis. Hoechst-färgämnen används ofta som ersättning för en annan nukleinsyrafläck som kallas DAPI .
Viktiga skillnader mellan Hoechst-färgämnen och DAPI är:
- Hoechst-färgämnen är mindre giftiga än DAPI, vilket garanterar en högre livskraft hos färgade celler
- Den ytterligare etylgruppen i Hoechst-färgämnena gör dem mer cellgenomsläppliga.
- Det finns kärnor som färgar färgämnen som möjliggör cellernas livskraft efter färgning.
Hoechst 33342 och 33258 är släcktes genom bromdeoxiuridin (BrdU), som vanligen används för att detektera celler som delar sig. Hoechst 33342 uppvisar en 10 gånger större cellpermeabilitet än H 33258. Celler kan integrera BrdU i nysyntesiserat DNA som en ersättning för tymidin . När BrdU integreras i DNA antas det att brom deformerar det mindre spåret så att Hoechst-färgämnen inte kan nå sitt optimala bindningsställe. Bindning av Hoechst-färgämnen är ännu starkare mot BrdU-substituerat DNA; emellertid följer ingen fluorescens. Hoechst-färgämnen kan användas med BrdU för att övervaka cellcykelprogression .
Hoechst-färgämnen används ofta för att fläcka genomiskt DNA i följande applikationer:
- Fluorescensmikroskopi och immunhistokemi , ofta med andra fluoroforer
- Flödescytometri för att räkna eller sortera celler. Ett exempel är användningen av Hoechst-färgämnen för att analysera hur många celler i en befolkning som är i vilken fas av cellcykeln
- Detektera DNA i närvaro av RNA i agarosgeler
- Automatiserad DNA-bestämning
- Kromosomsortering
Hoechst-utflödet används också för att studera hematopoetiska och embryonala stamceller. Eftersom dessa celler har möjlighet att effektivt flöda ut färgämnet kan de detekteras via flödescytometri i vad som kallas sidopopulationen . Detta görs genom att leda fluorescensen som emitteras från den upphetsade hoechst genom både röda och blå filter och plotta hoechst rött och blått mot varandra.
Toxicitet och säkerhet
Eftersom Hoechst-fläckar binder till DNA stör de DNA-replikering under celldelning . Följaktligen är de potentiellt mutagena och cancerframkallande , så försiktighet bör användas vid hantering och bortskaffande. Hoechst fläck används för att sortera spermier hos boskap och människor. Dess säkerhet har diskuterats.