Fragmentering (cellbiologi) - Fragmentation (cell biology)

I cellbiologi , sätt på vilka fragmentering är användbar för en cell: DNA-kloning och apoptos. DNA-kloning är viktigt vid aseksuell reproduktion eller skapande av identiska DNA-molekyler och kan utföras spontant av cellen eller avsiktligt av laboratorieforskare. Apoptos är den programmerade förstörelsen av celler, och DNA-molekylerna i dem, och är en mycket reglerad process. Dessa två sätt på vilka fragmentering används i cellulära processer beskriver normala cellfunktioner och vanliga laboratorieprocedurer som utförs med celler. Problem i en cell kan emellertid ibland orsaka fragmentering som resulterar i oregelbundenheter såsom fragmentering av röda blodkroppar och DNA-fragmentering av spermier.

DNA-kloning

DNA-kloning kan utföras spontant av cellen för reproduktionsändamål. Detta är en form av asexuell reproduktion där en organism delas upp i fragment och sedan utvecklas vart och ett av dessa fragment till mogna, fullvuxna individer som är kloner av den ursprungliga organismen (se reproduktiv fragmentering ). DNA-kloning kan också utföras avsiktligt av laboratorieforskare. Här är DNA-fragmentering en molekylär genetisk teknik som tillåter forskare att använda rekombinant DNA- teknik för att framställa ett stort antal identiska DNA-molekyler. För att DNA-kloning ska vara fullbordad är det nödvändigt att erhålla diskreta, små regioner av en organisms DNA som utgör specifika gener . Endast relativt små DNA-molekyler kan klonas i vilken som helst tillgänglig vektor . Därför måste de långa DNA-molekylerna som komponerar en organisms genom klyvas i fragment som kan sättas in i vektorns DNA. Två enzymer underlättar produktionen av sådana rekombinanta DNA-molekyler:

1. Restriktionsenzymer

Restriktionsenzymer är endonukleaser producerade av bakterier som vanligtvis känner igen små baspar-sekvenser (kallade restriktionsställen ) och sedan klyver båda DNA-strängarna på denna plats. Ett restriktionsställe är vanligtvis en palindrom sekvens , vilket innebär att sekvensen för restriktionsstället är densamma på varje DNA-sträng vid läsning i 5 'till 3' -riktningen.

För varje restriktionsenzym producerar bakterier också ett modifieringsenzym så att värdbakteriens eget DNA skyddas mot klyvning. Detta görs genom att modifiera värdens DNA vid eller i närheten av varje potentiellt klyvningsställe. Modifieringsenzymet tillför en metylgrupp till en eller två baser, och närvaron av denna metylgrupp förhindrar restriktionsendonukleaset från att skära DNA.

Klipp som skapar ett klibbigt slut

Klipp som skapar ett trubbigt slut

Många restriktionsenzymer gör förskjutna snitt i de två DNA-strängarna på deras igenkänningsställe, vilket alstrar fragment med en enkelsträngad "svans" som överhäng i båda ändarna, kallad en klibbig ände. Restriktionsenzymer kan också göra raka snitt i de två DNA-strängarna på deras igenkänningsställe, vilket genererar trubbiga ändar.

2. DNA-ligas

Under normal DNA-replikation katalyserar DNA-ligas en-till-än-sammanfogning (ligering) av korta fragment av DNA, kallad Okazaki-fragment . För DNA-kloning används renat DNA-ligas för att kovalent ansluta sig till ändarna av ett restriktionsfragment och vektor-DNA som har komplementära ändar. De är kovalent ligeras samman genom standard 3' till 5' fosfodiesterbindningar av DNA.

DNA-ligas kan ligera komplementära klibbiga och trubbiga ändar , men trubbiga ändar är ineffektiva och kräver en högre koncentration av både DNA och DNA-ligas än ligeringen av klibbiga ändar gör. Av denna anledning gör de flesta restriktionsenzymer som används vid DNA-kloning en delad snitt i DNA-strängarna för att skapa klibbiga ändar.

Nyckeln till kloning av ett DNA-fragment är att koppla det till en vektor-DNA-molekyl som kan replikeras i en värdcell. Efter att en enda rekombinant DNA-molekyl (sammansatt av en vektor plus ett infogat DNA-fragment) införts i en värdcell kan det insatta DNA: et replikeras tillsammans med vektorn, vilket genererar ett stort antal identiska DNA-molekyler. Det grundläggande schemat för detta kan sammanfattas enligt följande:

Vector + DNA-fragment

↓

Rekombinant DNA

↓

Replikering av rekombinant DNA i värdcellen

↓

Isolering, sekvensering och manipulering av renat DNA-fragment

Det finns många experimentella variationer för detta schema, men dessa steg är viktiga för DNA-kloning i ett laboratorium.

apoptos

Fragmentering är det tredje och sista steget i cellmontering under apoptos (höger sida av schemat).

Apoptos hänför sig till cellernas undergång genom en specifik form av programmerad celldöd , kännetecknad av en väldefinierad sekvens av morfologiska förändringar. Cellulär och nukleär krympning, kromatinkondensation och fragmentering, bildning av apoptotiska kroppar och fagocytos av angränsande celler karakteriserar de viktigaste morfologiska förändringarna i apoptosprocessen. Omfattande morfologiska och biokemiska förändringar under apoptos säkerställer att döende celler lämnar minimal påverkan på angränsande celler och / eller vävnader.

Gener som är involverade i att kontrollera celldöd kodar proteiner med tre distinkta funktioner:

• "Killer" -proteiner krävs för att en cell ska starta den apoptotiska processen
• "Destruction" -proteiner gör saker som att smälta DNA i en döende cell
• "Engulfment" -proteiner krävs för fagocytos av den dörande cellen av en annan cell

Spjälkning av kromosomalt DNA i mindre fragment är en integrerad del, och biokemiskt kännetecken, för apoptos. Apoptos involverar aktivering av endonukleaser med efterföljande klyvning av kromatin-DNA i fragment av 180 baspar eller multiplar av 180 baspar (t.ex. 360, 540). Detta fragment av mönster kan användas för att detektera apoptos i tester såsom en DNA-stegningsanalys med gelelektrofores , en TUNEL-analys eller en Nicoletti-analys . Apoptotisk DNA-fragmentering förlitar sig på ett enzym som kallas Caspase-Activated DNase (CAD) . CAD hämmas vanligtvis av ett annat protein i cellen, kallad Hämmare av kaspasaktiverat DNas (ICAD) . För att apoptos ska börja, klyver ett enzym som kallas caspase 3 ICAD så att CAD aktiveras. CAD klyver sedan DNA mellan nukleosomer , som förekommer i kromatin med 180 basparintervall. Platserna mellan nukleosomer är de enda delarna av DNA som är exponerade och tillgängliga för CAD.

oegentligheter

DNA-fragmentering kan ske under vissa förhållanden i några olika celltyper. Detta kan leda till problem för en cell, eller det kan leda till att en cell får en signal för att genomgå apoptos. Nedan följer ett par exempel på oregelbunden fragmentering som kan uppstå i celler.

1. Fragment av röda blodkroppar

En blodsmetning från en patient med hemolytisk anemi, visar schistocyter

En fragmenterad röd blodcell är känd som en schistocyt och är i allmänhet resultatet av en intracellulär mekanisk skada på de röda blodkropparna. En stor mängd schistocyter kan observeras. Schistocyter ses vanligen i relativt låga antal och är förknippade med förhållanden där det normalt släta endotelfodret eller endotelet är grovt eller oregelbundet och / eller det vaskulära lumenet korsas av fibrinsträngar . Schistocyter ses ofta hos patienter som har hemolytisk anemi . De är också ett kännetecken för avancerad järnbristanemi , men i detta fall är den observerade fragmenteringen troligen ett resultat av skörheten hos cellerna som produceras under dessa förhållanden.

2. Spermcell-DNA-fragmentering

I en genomsnittlig hane kommer mindre än 4% av hans spermier att innehålla fragmenterat DNA. Att delta i beteenden som rökning kan emellertid avsevärt öka DNA-fragmenteringen i spermier. Det finns en negativ korrelation mellan andelen DNA-fragmentering och rörlighet, morfologi och koncentration av spermier. Det finns också en negativ koppling mellan procentandelen spermier som innehåller fragmenterat DNA och befruktningsgraden och klyvningshastigheten för embryon.

referenser