Fluorescerande tagg - Fluorescent tag
Inom molekylärbiologi och bioteknik är en fluorescerande etikett , även känd som en fluorescerande etikett eller fluorescerande sond , en molekyl som är fäst kemiskt för att hjälpa till att detektera en biomolekyl, såsom ett protein, antikropp eller aminosyra. Generellt använder fluorescerande märkning eller märkning ett reaktivt derivat av en fluorescerande molekyl som kallas fluorofor . Fluoroforen binder selektivt till en specifik region eller funktionell grupp på målmolekylen och kan bindas kemiskt eller biologiskt. Olika märkningstekniker såsom enzymatisk märkning, proteinmärkning och genetisk märkning används i stor utsträckning. Etidiumbromid , fluorescein och grönt fluorescerande protein är vanliga taggar. De vanligast märkta molekylerna är antikroppar, proteiner, aminosyror och peptider som sedan används som specifika sonder för detektion av ett visst mål.
Historia
Utvecklingen av metoder för att upptäcka och identifiera biomolekyler har motiverats av förmågan att förbättra studiet av molekylär struktur och interaktioner. Innan fluorescerande märkning kom, användes radioisotoper för att detektera och identifiera molekylära föreningar. Sedan dess har säkrare metoder utvecklats som innebär användning av fluorescerande färgämnen eller fluorescerande proteiner som taggar eller sonder som ett sätt att märka och identifiera biomolekyler. Även om fluorescerande märkning i detta avseende endast nyligen har använts, har upptäckten av fluorescens funnits under mycket längre tid.
Sir George Stokes utvecklade Stokes Law of Fluorescence 1852 som säger att våglängden för fluorescensemission är större än den för den spännande strålningen. Richard Meyer kallade sedan fluorofor 1897 för att beskriva en kemisk grupp i samband med fluorescens. Sedan dess skapades Fluorescein som ett fluorescerande färgämne av Adolph von Baeyer 1871 och färgningsmetoden utvecklades och användes med utvecklingen av fluorescensmikroskopi 1911.
Etidiumbromid och varianter utvecklades på 1950 -talet, och 1994 infördes fluorescerande proteiner eller FP. Grönt fluorescerande protein eller GFP upptäcktes av Osamu Shimomura på 1960 -talet och utvecklades som en spårningsmolekyl av Douglas Prasher 1987. FP ledde till ett genombrott av levande cellavbildning med förmågan att selektivt märka genetiska proteinregioner och observera proteinfunktioner och mekanismer . För detta genombrott tilldelades Shimomura Nobelpriset 2008.
Nya metoder för att spåra biomolekyler har utvecklats, inklusive användning av kolorimetriska biosensorer, fotokromiska föreningar, biomaterial och elektrokemiska sensorer. Fluorescerande märkning är också en vanlig metod där applikationer har expanderat till enzymatisk märkning, kemisk märkning, proteinmärkning och genetisk märkning.
Metoder för att spåra biomolekyler
Det finns för närvarande flera märkningsmetoder för att spåra biomolekyler. Några av metoderna inkluderar följande.
Isotopmarkörer
Vanliga arter som isotopmarkörer används för inkluderar proteiner. I detta fall inkorporeras aminosyror med stabila isotoper av antingen kol, kväve eller väte i polypeptidsekvenser. Dessa polypeptider sätts sedan igenom masspektrometri . På grund av den exakt definierade förändringen som dessa isotoper uppstår på peptiderna är det möjligt att genom spektrometridiagrammet se vilka peptider som innehöll isotoperna. Genom att göra det kan man extrahera proteinet av intresse från flera andra i en grupp. Isotopiska föreningar spelar en viktig roll som fotokromer, beskrivna nedan.
Kolorimetriska biosensorer
Biosensorer är kopplade till ett ämne av intresse. Normalt skulle detta ämne inte kunna absorbera ljus, men med den bifogade biosensorn kan ljus absorberas och avges på en spektrofotometer . Dessutom kan biosensorer som är fluorescerande ses med blotta ögat. Vissa fluorescerande biosensorer har också förmågan att ändra färg i förändrade miljöer (t.ex. från blått till rött). En forskare skulle kunna inspektera och få data om den omgivande miljön baserat på vilken färg han eller hon kunde se synligt från biosensor-molekylhybriden.
Kolorimetriska analyser används normalt för att bestämma hur mycket koncentration av en art det finns i förhållande till en annan.
Fotokroma föreningar
Fotokroma föreningar har förmågan att växla mellan olika färger. Deras förmåga att visa olika färger ligger i hur de absorberar ljus. Olika isomera manifestationer av molekylen absorberar olika ljusets våglängder, så att varje isomerisk art kan visa en annan färg baserat på dess absorption. Dessa inkluderar fotoswitchbara föreningar, som är proteiner som kan växla från ett icke-fluorescerande tillstånd till ett fluorescerande tillstånd med en viss miljö.
Den vanligaste organiska molekylen som används som fotokrom är diaryleten . Andra exempel på fotoswitchbara proteiner inkluderar PADRON-C, rs-FastLIME-s och bs-DRONPA-s, som kan användas i både växt- och däggdjursceller för att se celler flytta in i olika miljöer.
Biomaterial
Fluorescerande biomaterial är ett möjligt sätt att använda yttre faktorer för att observera en väg mer synligt. Metoden innebär fluorescerande märkning av peptidmolekyler som skulle förändra en organismes naturliga väg. När denna peptid sätts in i organismens cell kan den framkalla en annan reaktion. Denna metod kan användas, till exempel för att behandla en patient och sedan synligt se behandlingens resultat.
Elektrokemiska sensorer
Elektrokemiska sensorer kan användas för märkningsfri avkänning av biomolekyler. De detekterar förändringar och mäter ström mellan en sonderad metallelektrod och en elektrolyt som innehåller målanalyten. En känd potential på elektroden appliceras sedan från en återkopplingsström och den resulterande strömmen kan mätas. Till exempel inkluderar en teknik som använder elektrokemisk avkänning långsamt att höja spänningen vilket orsakar att kemiska arter vid elektroden oxideras eller reduceras. Cellström vs spänning plottas som i slutändan kan identifiera mängden kemiska arter som förbrukas eller produceras vid elektroden. Fluorescerande taggar kan användas tillsammans med elektrokemiska sensorer för att lätt kunna upptäcka i ett biologiskt system.
Fluorescerande etiketter
Av de olika metoderna för märkning av biomolekyler är fluorescerande etiketter fördelaktiga genom att de är mycket känsliga även vid låg koncentration och icke-destruktiva för målmolekylens vikning och funktion.
Grönt fluorescerande protein är ett naturligt förekommande fluorescerande protein från maneterna Aequorea victoria som ofta används för att märka proteiner av intresse. GFP avger en foton i det gröna området i ljusspektrumet när den exciteras av absorptionen av ljus. Den kromofor består av en oxiderad tripeptid -Ser ^ 65-Tyr ^ 66-Gly ^ 67 beläget inom en β fat. GFP katalyserar oxidationen och kräver endast molekylärt syre. GFP har modifierats genom att ändra det absorberade ljusets våglängd till att inkludera andra färger av fluorescens. YFP eller gult fluorescerande protein , BFP eller blått fluorescerande protein och CFP eller cyan fluorescerande protein är exempel på GFP -varianter. Dessa varianter produceras av gentekniken för GFP -genen.
Syntetiska fluorescerande sonder kan också användas som fluorescerande etiketter. Fördelarna med dessa etiketter inkluderar en mindre storlek med mer variation i färger. De kan användas för att märka proteiner av intresse mer selektivt med olika metoder, inklusive kemisk igenkänningsbaserad märkning, såsom användning av metallkelaterande peptidtaggar och biologisk igenkänningsbaserad märkning med användning av enzymatiska reaktioner. Trots sitt stora utbud av excitations- och emissionsvåglängder samt bättre stabilitet tenderar syntetiska sonder att vara giftiga för cellen och används därför inte i allmänhet i cellbildningsstudier.
Fluorescerande etiketter kan hybridiseras till mRNA för att visualisera interaktion och aktivitet, till exempel mRNA -lokalisering. En antisenssträng märkt med den fluorescerande sonden är fäst vid en enda mRNA -sträng och kan sedan ses under cellutveckling för att se rörelsen av mRNA inuti cellen.
Fluorogena etiketter
En fluorogen är en ligand (fluorogen ligand) som inte i sig är fluorescerande, men när den är bunden av ett specifikt protein eller en RNA -struktur blir fluorescerande.
Till exempel är FAST en variant av fotoaktivt gult protein som konstruerades för att binda kemiska efterlikningar av GFP tripeptidkromoforen. På samma sätt är spenat aptamer en konstruerad RNA -sekvens som kan binda GFP -kromoforkemiska efterlikningar och därigenom ge villkorad och reversibel fluorescens till RNA -molekyler som innehåller sekvensen.
Användning av taggar i fluorescerande märkning
Fluorescerande märkning är känd för sin icke-destruktiva natur och höga känslighet. Detta har gjort det till en av de mest använda metoderna för märkning och spårning av biomolekyler. Flera tekniker för fluorescerande märkning kan användas beroende på målets art.
Enzymatisk märkning
Vid enzymatisk märkning bildas först en DNA -konstruktion, med användning av en gen och DNA från ett fluorescerande protein. Efter transkription bildas ett hybrid -RNA + fluorescerande. Objektet av intresse är knutet till ett enzym som kan känna igen detta hybrid -DNA. Vanligtvis används fluorescein som fluorofor.
Kemisk märkning
Kemisk märkning eller användning av kemiska taggar utnyttjar interaktionen mellan en liten molekyl och en specifik genetisk aminosyrasekvens. Kemisk märkning används ibland som ett alternativ för GFP. Syntetiska proteiner som fungerar som fluorescerande prober är mindre än GFP: s och kan därför fungera som sonder i en större variation av situationer. Dessutom erbjuder de ett bredare utbud av färger och fotokemiska egenskaper. Med de senaste framstegen inom kemisk märkning föredras kemiska taggar framför fluorescerande proteiner på grund av arkitektoniska och storleksbegränsningar för det fluorescerande proteinets karakteristiska β-fat. Ändringar av fluorescerande proteiner skulle leda till förlust av fluorescerande egenskaper.
Proteinmärkning
Proteinmärkning använder en kort tagg för att minimera störningar av proteingivning och funktion. Övergångsmetaller används för att länka specifika rester i taggarna till platsspecifika mål, såsom N-termini, C-termini eller interna platser i proteinet. Exempel på taggar som används för proteinmärkning inkluderar biarseniska taggar, Histidine -taggar och FLAG -taggar.
Genetisk märkning
Fluorescens in situ hybridisering (FISH), är ett exempel på en genetisk märkningsteknik som använder prober som är specifika för kromosomala platser längs en kromosoms längd, även känd som kromosommålning . Flera fluorescerande färgämnen som var och en har en distinkt excitations- och emissionsvåglängd är bundna till en sond som sedan hybridiseras till kromosomer. Ett fluorescensmikroskop kan upptäcka de närvarande färgämnena och skicka det till en dator som kan avslöja karyotypen av en cell. Denna teknik gör det möjligt att avslöja avvikelser som raderingar och dubbleringar.
Cellavbildning
Kemiska taggar har skräddarsys för bildteknik mer än fluorescerande proteiner eftersom kemiska taggar kan lokalisera fotosensibiliserare närmare målproteinerna. Proteiner kan sedan märkas och detekteras med avbildning såsom superupplösningsmikroskopi , Ca 2+ -bildning , pH-avkänning, väteperoxiddetektion, kromoforassisterad ljusinaktivering och ljusmikroskopi med flera foton. In vivo- avbildningsstudier på levande djur har utförts för första gången med användning av ett monomert protein härrörande från det bakteriella haloalkandealhalaset kallat Halo-taggen. Halo-taggen länkar kovalent till sin ligand och möjliggör bättre uttryck av lösliga proteiner.
Fördelar
Även om fluorescerande färgämnen kanske inte har samma känslighet som radioaktiva sonder, kan de visa realtidsaktivitet för molekyler i aktion. Dessutom är strålning och lämplig hantering inte längre ett problem.
Med utvecklingen av fluorescerande märkning har fluorescensmikroskopi möjliggjort visualisering av specifika proteiner i både fasta och levande cellbilder. Lokalisering av specifika proteiner har lett till viktiga begrepp inom cellulär biologi, såsom funktioner för olika grupper av proteiner i cellmembran och organeller. Vid levande cellavbildning möjliggör fluorescerande taggar rörelser av proteiner och deras interaktioner att övervakas.
De senaste framstegen inom metoder som involverar fluorescerande taggar har lett till visualisering av mRNA och dess lokalisering inom olika organismer. Levande cellavbildning av RNA kan uppnås genom att introducera syntetiserat RNA som är kemiskt kopplat till en fluorescerande tagg i levande celler genom mikroinjektion. Denna teknik användes för att visa hur Oskar mRNA i Drosophila embryo lokaliserar den bakre delen av äggcellen .
Se även
Anteckningar
externa länkar
|
Bibliotekets resurser om fluorescensspektroskopi |