Fluorescensavbildning - Fluorescence imaging

Flerfärgad fluorescensbild av levande HeLa -celler

Fluorescensavbildning är en typ av icke-invasiv bildteknik som kan hjälpa till att visualisera biologiska processer som sker i en levande organism. Bilder kan produceras från en mängd olika metoder, inklusive: mikroskopi , avbildningssonder och spektroskopi .

Fluorescensen i sig är en form av luminescens som härrör från materia som avger ljus med en viss våglängd efter att ha absorberat elektromagnetisk strålning . Molekyler som avger ljus igen vid absorption av ljus kallas fluoroforer .

Fluorescensavbildning fotograferar fluorescerande färgämnen och fluorescerande proteiner för att markera molekylära mekanismer och strukturer. Det gör att man experimentellt kan observera dynamiken i genuttryck , proteinuttryck och molekylära interaktioner i en levande cell. Det fungerar i huvudsak som ett exakt, kvantitativt verktyg när det gäller biokemiska tillämpningar.

En vanlig missuppfattning, fluorescens skiljer sig från bioluminescens genom hur proteinerna från varje process producerar ljus. Bioluminescens är en kemisk process som innebär att enzymer bryter ner ett substrat för att producera ljus. Fluorescens är den elektroniska excitationen av en elektron och efterföljande återgång för att avge ljus.

Attribut

Fluorescensmekanism

Diagram som visar samband mellan absorption och fluorescens

När en viss molekyl absorberar ljus höjs molekylens energi kort till ett högre upphetsat tillstånd. Den efterföljande återgången till marktillstånd resulterar i utsläpp av fluorescerande ljus som kan detekteras och mätas. Det utsända ljuset, som härrör från den absorberade foton av energi hv , har en specifik våglängd. Det är viktigt att känna till denna våglängd i förväg så att när ett experiment pågår vet mätanordningen vilken våglängd som ska ställas in för att detektera ljusproduktion. Denna våglängd bestäms av ekvationen:

Där h = Plancks konstant och c = ljusets hastighet. Vanligtvis används en stor skanningsenhet eller CCD här för att mäta intensiteten och digitalt fotografera en bild.

Fluorescerande färgämnen kontra proteiner

Fluorescerande färgämnen, utan mognadstid, ger högre fotostabilitet och ljusstyrka jämfört med fluorescerande proteiner. När det gäller ljusstyrka är ljusstyrkan beroende av fluoroforernas extinktionskoefficient eller förmåga att absorbera ljus och dess kvanteffektivitet eller effektivitet vid omvandling av absorberat ljus till fluorescerande emitterande luminescens. Färgämnena i sig är inte särskilt fluorescerande, men när de binder till proteiner blir de lättare detekterbara. Ett exempel, NanoOrange, binder till beläggningen och de hydrofoba regionerna i ett protein samtidigt som de är immuna mot reducerande medel. När det gäller proteiner fluorescerar dessa molekyler själva när de absorberar en specifik infallande ljusvåglängd. Ett exempel på detta, grönt fluorescerande protein (GFP), fluorescerar grönt när det utsätts för ljus i det blå till UV -området. Fluorescerande proteiner är utmärkta reportermolekyler som kan hjälpa till att lokalisera proteiner, observera proteinbindning och kvantifiera genuttryck.

Bildomfång

Eftersom vissa fluorescensvåglängder ligger utanför det mänskliga ögat, används laddade kopplade enheter (CCD) för att exakt detektera ljus och bild av emissionen. Detta sker vanligtvis i intervallet 300 - 800 nm. En av fördelarna med fluorescerande signalering är att intensiteten hos utsänt ljus uppträder ganska linjärt vad gäller mängden fluorescerande molekyler som tillhandahålls. Detta är uppenbarligen betingat av att den absorberade ljusintensiteten och våglängden är konstanta. När det gäller själva bilden är den vanligtvis i ett 12-bitars eller 16-bitars dataformat.

Grönt fluorescerande protein (GFP) belyses under UV -ljus i tre laboratoriemöss

Bildsystem

Huvudkomponenterna i fluorescensavbildningssystem är:

  • Excitationskälla- en enhet som antingen producerar en källa med bred våglängd som UV-ljus, eller en smal våglängdskälla som en laser.
  • Ljusdisplayoptik- vars mekanism belyser provet. Detta görs vanligtvis genom direkt belysning av provet.
  • Ljussortimentoptik- insamlingsmetoden för själva ljuset. Detta utgör vanligtvis linser, speglar och filter.
  • Filtrering av utsända ljusoptiska filter säkerställer att reflekterat och spritt ljus inte ingår i fluorescensen. De tre klasserna av utsläppsfilter är long-pass, short-pass och band-pass.
  • Detektion, förstärkning och visualisering- antingen fotomultiplikator (PMT) eller laddningspar-enhet (CCD) används för att detektera och kvantifiera utsända fotoner


Ansökningar

  • I PCR (agarosgelelektrofores)- SYBR Green är ett mycket vanligt färgämne som binder till DNA och används för att visualisera DNA-band i en agarosgel. Färgen absorberar blått ljus och fluorescerar grönt för ett bildsystem att fånga.
  • Blotting (västra, norra och södra)- fluorokromer kan binda till antikroppar, RNA och DNA för att fluorescera och kvantifiera data
  • DNA-sekvensering- Sanger-sekvensering är en vanlig form av nukleinsyradetektering som kan använda fluorescensmärkta ddNTP för bildfluorescens-toppar
  • Fluorescensbild guidad kirurgi- är en medicinsk bildbehandling som fluorescerande märker en massa för att underlätta navigering. Till exempel kan indocyaningrönt användas för att upptäcka lymfkörtlar hos cancerpatienter.
  • Fluorescensavbildning med en nanometer noggrannhet (FIONA)- använder total intern reflektionsbelysning för att minska buller och öka ljusstyrkan hos fluoroforer
  • Kalciumbildning- teknik som använder fluorescerande molekyler som kallas kalciumindikatorer som förändras i fluorescens när de är bundna till Ca 2+ joner. Detta är en viktig del för att se när celler är aktiva i nervsystemet.
Agarosgel med etidiumbromid som fluorescerande tagg under UV -ljusbelysning

Typer av mikroskopi

En annan uppsättning mikroskoptekniker kan användas för att ändra visualisering och kontrast för en bild. Varje metod har för- och nackdelar, men alla använder samma fluorescensmekanism för att observera en biologisk process.

  • Total inre reflektionsfluorescensmikroskopi- är en mikroskopiteknik som använder svängande vågor för att selektivt observera fluorescensen hos en enda molekyl.
  • Ljusarkfluorescensmikroskopi- är en fluorescensmikroskopiteknik som belyser en tunn bit av ett prov vid en vinkelrät undersökningsvinkel.
  • Fluorescens-livslängd bildmikroskopi- är en bildteknik som registrerar förändringar i fluorescens över tid

Fördelar

  • Icke-invasiv avbildning in vivo kan ske utan att behöva punktera huden
  • Sensitive-sonder är utformade för att vara extremt känsliga för att detektera biologiska molekyler som DNA, RNA och proteiner.
  • Multimärkning- flera fluorokromer kan detekteras i proverna vilket möjliggör ett enkelt sätt att integrera standarder och en kontroll.
  • Stabiliteten hos märkta molekyler- fluorescensmärkta molekyler som används vid avbildning kan lagras i flera månader medan andra molekyler som sådana som är radiomärkta kommer att förfalla under några dagar.
  • Relativt säkert att hantera- de flesta fluoroforer kan hanteras säkert och tillräckligt med handskar, medan radioisotoper till exempel kan kräva blyskydd eller annat strålskydd.
  • Enkel avfallshantering- många fluoroforer kräver minimala bortskaffningsmetoder medan radioaktivt avfall kräver reglerad kassering och långsiktig hantering. Detta hjälper också till att sänka kostnaden för att använda dessa produkter.
Exempel på fluorescensmikroskop med en laddad kopplad enhet (CCD) för att ta bilder

Nackdelar

  • Fotoblekning- är ett vanligt problem med fluoroforer där den konstanta cykeln mellan marktillstånd och upphetsat tillstånd skadar molekylen och minskar dess intensitet.
  • Miljömottaglighet- miljöfaktorer som temperatur, jonkoncentration och pH kan påverka effektiviteten och utsläppet av fluorokromer
  • Toxicitet- vissa fluorokromer kan vara giftiga för celler, vävnader, in vivo eller genom att producera mutationer.
  • Begränsad upplösningseffekt-fluorescensmikroskop är begränsade i deras förmåga att skilja nära objekt på makroskopisk nivå. I jämförelse har till exempel elektronmikroskop kapacitet att lösa sig vid ett mycket mindre område.
  • Begränsat initialt ljusstyrkaintervall- incidensljuskällans intensitet har en gräns och bortom denna punkt kan det resultera i fotodestruktion av molekyler.

Sammantaget är denna form av avbildning extremt användbar i spetskundersökning, med sin förmåga att övervaka biologiska processer. Utvecklingen från 2D -fluorescerande bilder till 3D -bilder har gjort det möjligt för forskare att bättre studera rumslig precision och upplösning. Dessutom, med koncentrerade ansträngningar för 4D -analys, kan forskare nu övervaka en cell i realtid, så att de kan övervaka snabbverkande processer.

Framtida inriktningar

Varierande färger av fluorescens från olika fluorescerande proteiner

Att utveckla mer effektiva fluorescerande proteiner är en uppgift som många forskare har tagit upp för att förbättra bildsondens möjligheter. Ofta kan mutationer i vissa rester signifikant förändra proteinets fluorescerande egenskaper. Till exempel, genom att mutera F64L -genen i maneter GFP, kan proteinet fluorescera mer effektivt vid 37 ° C, ett viktigt attribut att ha när man odlar kulturer i ett laboratorium. Utöver detta kan genteknik producera ett protein som avger ljus vid en bättre våglängd eller frekvens. Dessutom kan miljön i sig spela en avgörande roll. Fluorescens livslängd kan stabiliseras i en polär miljö.

Mekanismer som har beskrivits väl men inte nödvändigtvis införlivats i praktiska tillämpningar har en lovande potential för fluorescensavbildning. Fluorescensresonansenergioverföring (FRET) är en extremt känslig mekanism som producerar signalmolekyler i intervallet 1-10 nm.

Förbättringar i de tekniker som utgör fluorescensprocesser är också avgörande för effektivare konstruktioner. Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en analysteknik som observerar fluktuationen av fluorescensintensitet. Denna analys är en komponent i många fluorescensavbildningsmaskiner och förbättringar av rumslig upplösning kan förbättra känsligheten och räckvidden.

Utveckling av mer känsliga sonder och analytiska tekniker för laserinducerad fluorescens kan möjliggöra mer exakta, uppdaterade experimentella data.

Se även

Vidare läsning

"Imaging Trace Metals in Biological Systems" s. 81-134 i "Metals, Microbes and Minerals: The Biogeochemical Side of Life" (2021) s. Xiv + 341. Författare Yu, Jyao; Harankhedkar, Shefali; Nabatilan, Arielle; Fahrni, Christopher; Walter de Gruyter, Berlin. Redaktörer Kroneck, Peter MH och Sosa Torres, Martha. DOI 10.1515/9783110589771-004

Referenser