Transformation (genetik) - Transformation (genetics)
Inom molekylärbiologi och genetik är transformation den genetiska förändringen av en cell som härrör från direkt upptag och införlivande av exogent genetiskt material från sin omgivning genom cellmembranet (erna). För att transformationen ska äga rum måste mottagarbakterien befinna sig i ett kompetensläge , vilket kan förekomma i naturen som ett tidsbegränsat svar på miljöförhållanden som svält och celltäthet, och kan också induceras i ett laboratorium.
Transformation är en av tre processer för horisontell genöverföring , där exogent genetiskt material passerar från en bakterie till en annan, de andra två är konjugering (överföring av genetiskt material mellan två bakterieceller i direktkontakt) och transduktion (injektion av främmande DNA med en bakteriofagvirus in i värdbakterien). Vid transformation passerar det genetiska materialet genom det mellanliggande mediet, och upptaget är helt beroende av mottagarbakterien.
Från och med 2014 var cirka 80 bakteriearter kända för att kunna transformeras, ungefär jämnt fördelade mellan grampositiva och gramnegativa bakterier ; antalet kan vara en överskattning eftersom flera av rapporterna stöds av enstaka papper.
"Transformation" kan också användas för att beskriva införandet av nytt genetiskt material i icke -bakteriella celler, inklusive djur- och växtceller; emellertid, eftersom " transformation " har en speciell betydelse i förhållande till djurceller, vilket indikerar progression till ett cancertillstånd, kallas processen vanligtvis " transfektion ".
Historia
Transformation i bakterier demonstrerades första gången 1928 av den brittiska bakteriologen Frederick Griffith . Griffith var intresserad av att avgöra om injektioner av värmedödade bakterier skulle kunna användas för att vaccinera möss mot lunginflammation. Han upptäckte dock att en icke-virulent stam av Streptococcus pneumoniae kan göras virulent efter att ha utsatts för värmedödda virulenta stammar. Griffith antog att någon " omvandlingsprincip " från den värmedödade stammen var ansvarig för att göra den ofarliga stammen virulent. År 1944 identifierades denna "transformerande princip" som genetisk av Oswald Avery , Colin MacLeod och Maclyn McCarty . De isolerade DNA från en virulent stam av S. pneumoniae och med hjälp av just detta DNA kunde man göra en ofarlig stam virulent. De kallade detta upptag och införlivande av DNA genom bakterier "transformation" (Se Avery-MacLeod-McCarty-experimentet ) Resultaten av Avery et al.s experiment mottogs först skeptiskt av det vetenskapliga samfundet och det var inte förrän utvecklingen av genetiska markörer och upptäckten av andra metoder för genetisk överföring ( konjugering 1947 och transduktion 1953) av Joshua Lederberg att Averys experiment accepterades.
Man trodde ursprungligen att Escherichia coli , en vanlig laboratorieorganism, var eldfast mot transformation. Men 1970 visade Morton Mandel och Akiko Higa att E. coli kan induceras att ta upp DNA från bakteriofag λ utan användning av hjälpfag efter behandling med kalciumkloridlösning. Två år senare 1972 visade Stanley Norman Cohen , Annie Chang och Leslie Hsu att CaCl
2behandlingen är också effektiv för transformation av plasmid -DNA. Metoden för transformation av Mandel och Higa förbättrades senare av Douglas Hanahan . Upptäckten av artificiellt inducerad kompetens inom E. coli skapade ett effektivt och bekvämt förfarande för att transformera bakterier som möjliggör enklare molekylära kloningsmetoder inom bioteknik och forskning , och det är nu ett rutinmässigt använt laboratorieförfarande.
Transformation med hjälp av elektroporation utvecklades i slutet av 1980-talet, vilket ökade effektiviteten för in vitro-transformation och ökade antalet bakteriestammar som kunde transformeras. Transformation av djur- och växtceller undersöktes också med att den första transgena musen skapades genom att en gen för ett råttväxthormon injicerades i ett musembryo 1982. År 1897 upptäcktes en bakterie som orsakade växttumörer, Agrobacterium tumefaciens , och i början av 1970-talet befanns det tumörinducerande medlet vara en DNA- plasmid som kallas Ti-plasmiden . Genom att ta bort generna i plasmiden som orsakade tumören och lägga till nya gener kunde forskare infektera växter med A. tumefaciens och låta bakterierna sätta in deras valda DNA i plantornas genomer. Alla växtceller är inte mottagliga för infektion av A. tumefaciens , så andra metoder utvecklades, inklusive elektroporering och mikroinjektion . Partikelbombardering möjliggjordes med uppfinningen av Biolistic Particle Delivery System (genpistol) av John Sanford på 1980 -talet.
Definitioner
Transformation är en av tre former av horisontell genöverföring som förekommer i naturen bland bakterier, i vilka DNA som kodar för en egenskap passerar från en bakterie till en annan och integreras i mottagarens genom genom homolog rekombination ; de andra två är transduktion , utförd med hjälp av en bakteriofag , och konjugering , i vilken en gen passerar genom direkt kontakt mellan bakterier. Vid transformation passerar det genetiska materialet genom det mellanliggande mediet, och upptaget är helt beroende av mottagarbakterien.
Kompetens avser ett tillfälligt tillstånd av att kunna ta upp exogent DNA från miljön; det kan induceras i ett laboratorium.
Det verkar vara en gammal process som ärvts från en vanlig prokaryot förfader som är en fördelaktig anpassning för att främja rekombinationsreparation av DNA -skador, särskilt skador som förvärvats under stressiga förhållanden. Naturlig genetisk transformation verkar vara en anpassning för reparation av DNA -skador som också genererar genetisk mångfald .
Transformation har studerats i medicinskt viktiga gramnegativa bakteriearter som Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae och Vibrio cholerae . Det har också studerats hos gramnegativa arter som finns i jord som Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi och gramnegativa växtpatogener som Ralstonia solanacearum och Xylella fastidiosa . Transformation bland grampositiva bakterier har studerats i medicinskt viktiga arter som Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus och Streptococcus sanguinis och i Gram-positiv markbakterie Bacillus subtilis . Det har också rapporterats i minst 30 arter av Proteobacteria fördelade i klasserna alfa, beta, gamma och epsilon . De bäst studerade Proteobakterierna med avseende på transformation är de medicinskt viktiga mänskliga patogenerna Neisseria gonorrhoeae (klass beta), Haemophilus influenzae (klass gamma) och Helicobacter pylori (klass epsilon)
"Transformation" kan också användas för att beskriva införandet av nytt genetiskt material i icke -bakteriella celler, inklusive djur- och växtceller; emellertid, eftersom " transformation " har en speciell betydelse i förhållande till djurceller, vilket indikerar progression till ett cancertillstånd, kallas processen vanligtvis " transfektion ".
Naturlig kompetens och transformation
Från och med 2014 var cirka 80 bakteriearter kända för att kunna transformeras, ungefär jämnt fördelade mellan grampositiva och gramnegativa bakterier ; antalet kan vara en överskattning eftersom flera av rapporterna stöds av enstaka papper.
Naturligt kompetenta bakterier bär uppsättningar av gener som tillhandahåller proteinmaskineriet för att föra DNA över cellmembranet (erna). Transporten av det exogena DNA: t till cellerna kan kräva proteiner som är involverade i sammansättningen av typ IV -pili och typ II -sekretionssystem , liksom DNA -translokaskomplex vid det cytoplasmatiska membranet.
På grund av skillnaderna i cellhöljet mellan grampositiva och gramnegativa bakterier finns det vissa skillnader i mekanismerna för DNA-upptag i dessa celler, men de flesta av dem har gemensamma drag som involverar relaterade proteiner. DNA: t binder först till ytan av de kompetenta cellerna på en DNA -receptor och passerar genom det cytoplasmatiska membranet via DNA -translokas. Endast enkelsträngat DNA får passera igenom, den andra strängen bryts ned av nukleaser i processen. Det translokerade enkelsträngade DNA: t kan sedan integreras i bakteriekromosomerna genom en RecA -beroende process. I gramnegativa celler kräver DNA på grund av närvaron av ett extra membran närvaron av en kanal som bildas av sekretiner på det yttre membranet. Pilin kan krävas för kompetens, men dess roll är osäker. Upptagningen av DNA är generellt icke-sekvensspecifik, även om närvaron av specifika DNA-upptagningssekvenser hos vissa arter kan underlätta effektiv DNA-upptagning.
Naturlig omvandling
Naturlig transformation är en bakteriell anpassning för DNA -överföring som beror på uttrycket av många bakteriegener vars produkter verkar vara ansvariga för denna process. I allmänhet är transformation en komplex, energikrävande utvecklingsprocess. För att en bakterie ska binda, ta upp och rekombinera exogent DNA i sin kromosom måste den bli kompetent, det vill säga gå in i ett speciellt fysiologiskt tillstånd. Kompetensutveckling i Bacillus subtilis kräver uttryck av cirka 40 gener. DNA integrerat i värdkromosomen härrör vanligtvis (men med sällsynta undantag) från en annan bakterie av samma art och är således homolog med den bosatta kromosomen.
I B. subtilis är längden på det överförda DNA större än 1271 kb (mer än 1 miljon baser). Den överförda längden är sannolikt dubbelsträngat DNA och är ofta mer än en tredjedel av den totala kromosomlängden på 4215 kb. Det verkar som om cirka 7-9% av mottagarcellerna tar upp en hel kromosom.
Kapaciteten för naturlig transformation verkar förekomma i ett antal prokaryoter, och hittills är 67 prokaryota arter (i sju olika filer) kända för att genomgå denna process.
Kompetens för transformation induceras vanligtvis av hög celltäthet och/eller näringsbegränsning, förhållanden associerade med den stationära fasen av bakterietillväxt. Transformation i Haemophilus influenzae sker mest effektivt i slutet av exponentiell tillväxt när bakterietillväxten närmar sig den stationära fasen. Transformation i Streptococcus mutans , liksom i många andra streptokocker, sker vid hög celltäthet och är associerad med biofilmbildning . Kompetens inom B. subtilis induceras mot slutet av logaritmisk tillväxt, särskilt under förhållanden med aminosyrabegränsning. På samma sätt, i Micrococcus luteus (en representant för det mindre väl studerade Actinobacteria phylum), utvecklas kompetens under den mitten av sena exponentiella tillväxtfasen och utlöses också av aminosyrasvält.
Genom att frigöra intakt värd- och plasmid -DNA anses vissa bakteriofager bidra till transformation.
Transformation, som en anpassning för DNA -reparation
Kompetens induceras specifikt av DNA -skadliga förhållanden. Exempelvis induceras transformation i Streptococcus pneumoniae av de DNA-skadliga medlen mitomycin C (ett DNA-tvärbindningsmedel) och fluorokinolon (en topoisomerashämmare som orsakar dubbelsträngade avbrott). I B. subtilis ökas transformationen med UV -ljus, ett DNA -skadligt medel. I Helicobacter pylori inducerar ciprofloxacin, som interagerar med DNA-gyras och introducerar dubbelsträngspauser, uttryck av kompetensgener, vilket ökar transformationsfrekvensen med hjälp av Legionella pneumophila , Charpentier et al. testade 64 giftiga molekyler för att avgöra vilka av dessa som inducerar kompetens. Av dessa orsakade bara sex, alla DNA -skadliga medel, stark induktion. Dessa DNA-skadliga medel var mitomycin C (som orsakar tvärbindningar mellan DNA-strängar), norfloxacin, ofloxacin och nalidixinsyra (hämmare av DNA-gyras som orsakar dubbelsträngsavbrott), bicyklomycin (orsakar enkel- och dubbelsträngade avbrott) och hydroxikurea (inducerar oxidation av DNA -bas). UV -ljus inducerade också kompetens i L. pneumophila . Charpentier et al. föreslog att kompetens för transformation troligen utvecklades som ett DNA -skadesvar.
Logaritmiskt växande bakterier skiljer sig från stationära fasbakterier med avseende på antalet genomkopior som finns i cellen, och detta har konsekvenser för förmågan att utföra en viktig DNA -reparationsprocess . Under logaritmisk tillväxt kan två eller flera kopior av någon särskild region av kromosomen finnas i en bakteriecell, eftersom celldelning inte exakt matchas med kromosomreplikation. Processen för homolog rekombinationsreparation (HRR) är en nyckel-DNA-reparationsprocess som är särskilt effektiv för att reparera skador på dubbelsträngar, såsom dubbelsträngsavbrott. Denna process beror på en andra homolog kromosom utöver den skadade kromosomen. Under logaritmisk tillväxt kan en DNA -skada i en kromosom repareras med HRR med hjälp av sekvensinformation från den andra homologa kromosomen. När cellerna närmar sig den stationära fasen har de emellertid vanligtvis bara en kopia av kromosomen, och HRR kräver inmatning av homolog mall från utsidan av cellen genom transformation.
För att testa om transformations adaptiva funktion är reparation av DNA -skador, utfördes en rad experiment med B. subtilis bestrålad av UV -ljus som det skadliga medlet (granskat av Michod et al. Och Bernstein et al.) Resultaten av dessa experiment indikerade att transformerande DNA fungerar för att reparera potentiellt dödliga DNA -skador som införts av UV -ljus i mottagar -DNA: t. Den speciella processen som var ansvarig för reparation var sannolikt HRR. Transformation i bakterier kan ses som en primitiv sexuell process, eftersom det innebär interaktion av homologt DNA från två individer för att bilda rekombinant DNA som överförs till efterföljande generationer. Bakteriell transformation i prokaryoter kan ha varit den förfädersprocess som gav upphov till meiotisk sexuell reproduktion hos eukaryoter (se Evolution av sexuell reproduktion ; Meios .)
Metoder och mekanismer för transformation i laboratoriet
Bakteriell
Konstgjord kompetens kan induceras i laboratorieprocedurer som innebär att göra cellen passivt permeabel för DNA genom att utsätta den för förhållanden som normalt inte förekommer i naturen. Normalt inkuberas cellerna i en lösning som innehåller tvåvärda katjoner (ofta kalciumklorid ) under kalla förhållanden, innan de utsätts för en värmepuls (värmechock). Kalciumklorid stör delvis cellmembranet, vilket gör att rekombinant DNA kan komma in i värdcellen. Celler som kan ta upp DNA kallas kompetenta celler.
Det har visat sig att tillväxt av gramnegativa bakterier i 20 mM Mg minskar antalet protein-till- lipopolysackaridbindningar genom att öka förhållandet mellan joniska och kovalenta bindningar, vilket ökar membranfluiditeten, vilket underlättar transformation. Lipopolysackaridernas roll här verifieras från observationen att kortare O-sidokedjor transformeras mer effektivt-kanske på grund av förbättrad DNA-tillgänglighet.
Ytan på bakterier som E. coli är negativt laddad på grund av fosfolipider och lipopolysackarider på cellens yta, och DNA: t laddas också negativt. En funktion av den tvåvärda katjonen skulle därför vara att skydda laddningarna genom att koordinera fosfatgrupperna och andra negativa laddningar, och därigenom låta en DNA -molekyl fästa vid cellytan.
DNA -inträde i E. coli -celler sker genom kanaler som kallas vidhäftningszoner eller Bayers korsning, med en typisk cell som bär upp till 400 sådana zoner. Deras roll etablerades när kobalamin (som också använder dessa kanaler) befanns konkurrenskraftigt hämma DNA -upptag. En annan typ av kanal som är inblandad i DNA -upptag består av poly (HB): poly P: Ca. I denna poly (HB) är tänkt att linda runt DNA (i sig ett polyfosfat) och bärs i en sköld bildad av Ca joner.
Det föreslås att exponering av cellerna för tvåvärda katjoner i kallt tillstånd också kan förändra eller försvaga cellytans struktur, vilket gör den mer genomsläpplig för DNA. Värmepulsen tros skapa en termisk obalans över cellmembranet, vilket tvingar DNA: t att komma in i cellerna genom antingen cellporer eller den skadade cellväggen.
Elektroporation är en annan metod för att främja kompetens. I denna metod chockas cellerna kortvarigt med ett elektriskt fält på 10-20 kV /cm, vilket antas skapa hål i cellmembranet genom vilket plasmid-DNA kan komma in. Efter elchocken stängs hålen snabbt av cellens membranreparationsmekanismer.
Jäst
De flesta jästarter , inklusive Saccharomyces cerevisiae , kan transformeras av exogent DNA i miljön. Flera metoder har utvecklats för att underlätta denna transformation vid hög frekvens i labbet.
- Jästceller kan behandlas med enzymer för att bryta ner deras cellväggar, vilket ger sfäroplaster . Dessa celler är mycket ömtåliga men tar upp främmande DNA i hög takt.
- Exponera intakta jästceller till alkali- katjoner såsom de av cesium eller litium tillåter cellerna att ta upp plasmid-DNA. Senare protokoll anpassade denna transformationsmetod med litiumacetat , polyetylenglykol och enkelsträngat DNA. I dessa protokoll binder enkelsträngat DNA företrädesvis till jästcellväggen, vilket förhindrar att plasmid-DNA gör det och lämnar det tillgängligt för transformation.
- Elektroporering : Bildande av övergående hål i cellmembranen med elektrisk stöt; detta gör att DNA kan komma in enligt beskrivningen ovan för bakterier.
- Enzymatisk matsmältning eller omrörning med glaspärlor kan också användas för att transformera jästceller.
Effektivitet - Olika jästsläkten och arter tar upp främmande DNA med olika effektivitet. De flesta transformationsprotokoll har också utvecklats för bagerjäst, S. cerevisiae , och kan därför inte vara optimala för andra arter. Även inom en art har olika stammar olika transformationseffektiviteter, ibland olika med tre storleksordningar. Till exempel, när S. cerevisiae-stammar transformerades med 10 ug plasmid YEp13, gav stammen DKD-5D-H mellan 550 och 3115 kolonier medan stam OS1 gav färre än fem kolonier.
Växter
Ett antal metoder finns tillgängliga för att överföra DNA till växtceller. Vissa vektor medierad metoder är:
- Agrobacterium -medierad transformation är den enklaste och enklaste växttransformationen. Växtvävnad (ofta blad) skärs i små bitar, t.ex. 10x10 mm, och blötläggs i tio minuter i en vätska som innehåller suspenderad Agrobacterium . Bakterierna kommer att fästa vid många av växtcellerna som utsätts av snittet. Växtcellerna utsöndrar sårrelaterade fenolföreningar som i sin tur verkar för att uppreglera virulensoperonet i Agrobacterium. Virulensoperonet innehåller många gener som kodar för proteiner som ingår i ett typ IV -utsöndringssystem som exporterar från bakterieproteinerna och DNA (avgränsat av specifika igenkänningsmotiv som kallas gränssekvenser och skärs ut som en enda sträng från virulensplasmiden) till växten. cell genom en struktur som kallas pilus. Det överförda DNA: t (kallas T-DNA) styrs till växtcellskärnan av kärnlokaliseringssignaler som finns i Agrobacterium-proteinet VirD2, som är kovalent fäst vid slutet av T-DNA vid den högra gränsen (RB). Exakt hur T-DNA integreras i värdväxtens genomiska DNA är ett aktivt område inom växtbiologisk forskning. Om vi antar att en selektionsmarkör (såsom en antibiotikaresistensgen) inkluderades i T-DNA: t, kan den transformerade växtvävnaden odlas på selektiva medier för att producera skott. Skotten överförs sedan till ett annat medium för att främja rotbildning. När rötterna börjar växa från den transgena skotten kan växterna överföras till jorden för att slutföra en normal livscykel (gör frön). Fröna från denna första växt (kallad T1, för första transgena generationen) kan planteras på en selektiv (som innehåller ett antibiotikum), eller om en herbicidresistensgen användes, kan alternativt planteras i jord och sedan behandlas med herbicid till döda segreganter av vildtyp. Vissa växter, som Arabidopsis thaliana, kan omvandlas genom att doppa blommorna eller hela växten till en suspension av Agrobacterium tumefaciens , typiskt stam C58 (C = Cherry, 58 = 1958, året då denna speciella stam av A. tumefaciens var isolerad från ett körsbärsträd i en fruktträdgård vid Cornell University i Ithaca, New York). Även om många växter fortfarande är motsträviga till transformation med denna metod, pågår forskning som fortsätter att lägga till listan de arter som har modifierats på detta sätt.
- Viral transformation ( transduktion ): Förpacka det önskade genetiska materialet till ett lämpligt växtvirus och låt detta modifierade virus infektera växten. Om det genetiska materialet är DNA kan det rekombinera med kromosomerna för att producera transformanta celler. Genomen för de flesta växtvirus består emellertid av enkelsträngat RNA som replikerar i cytoplasman hos infekterad cell. För sådana genom är denna metod en form av transfektion och inte en verklig transformation, eftersom de insatta generna aldrig når cellens kärna och inte integreras i värdgenomet. Avkomman till de infekterade växterna är virusfri och även fri från den insatta genen.
Några vektorfria metoder inkluderar:
- Genpistol : Kallas även partikelbombardering, mikroprojektilbombardering eller biologistik. Partiklar av guld eller volfram beläggs med DNA och skjuts sedan in i unga växtceller eller växtembryon. Viss genetiskt material kommer att stanna kvar i cellerna och transformera dem. Denna metod möjliggör också omvandling av växtplastider. Den transformationseffektiviteten är lägre än i Agrobacterium -medierad transformation, men de flesta växter kan transformeras med denna metod.
- Elektroporering : Bildande av övergående hål i cellmembranen med användning av elektriska pulser med hög fältstyrka; detta gör att DNA kan komma in enligt beskrivningen ovan för bakterier.
Svampar
Det finns några metoder för att producera transgena svampar, de flesta av dem är analoga med de som används för växter. Svampar måste dock behandlas annorlunda på grund av några av deras mikroskopiska och biokemiska egenskaper:
- En stor fråga är det dikaryota tillståndet som delar av vissa svampar befinner sig i; dikaryota celler innehåller två haploida kärnor, en av varje föräldrasvamp. Om bara en av dessa transformeras, vilket är regeln, minskar andelen transformerade kärnor efter varje sporulation .
- Svampcellväggar är ganska tjocka och hindrar DNA -upptagning så (delvis) avlägsnande krävs ofta; fullständig nedbrytning, vilket ibland är nödvändigt, ger protoplaster .
- Myceliala svampar består av filamentösa hyfer , som, om alls, separeras av inre cellväggar avbrutna av porer som är tillräckligt stora för att göra det möjligt för näringsämnen och organeller, ibland även kärnor, att resa genom varje hyfa. Som ett resultat kan enskilda celler vanligtvis inte separeras. Detta är problematiskt eftersom närliggande transformerade celler kan göra otransformerade immuna mot selektionsbehandlingar, t.ex. genom att leverera näringsämnen eller proteiner för antibiotikaresistens.
- Dessutom sker tillväxt (och därmed mitos) av dessa svampar uteslutande på toppen av deras hyfer som också kan ge problem.
Som nämnts tidigare fungerar en rad metoder som används för växttransformation också i svampar:
- Agrobacterium kan inte bara infektera växter utan även svampar, men till skillnad från växter utsöndrar svampar inte de fenolföreningar som är nödvändiga för att utlösa Agrobacterium så att de måste tillsättas, t.ex. i form av acetosyringon .
- Tack vare utvecklingen av ett expressionssystem för små RNA i svampar blev det möjligt att införa ett CRISPR/CAS9-system i svampceller. År 2016 förklarade USDA att det inte kommer att reglera en svampstam med vita knappar redigerade med CRISPR/CAS9 för att förhindra att fruktkroppen brynar och orsaka en bred diskussion om att släppa ut CRISPR/CAS9-redigerade grödor på marknaden.
- Fysiska metoder som elektroporering, biolistik ("genpistol"), sonoporation som använder kavitation av gasbubblor som produceras av ultraljud för att tränga igenom cellmembranet, etc. är också tillämpliga på svampar.
Djur
Introduktion av DNA i djurceller kallas vanligtvis transfektion och diskuteras i motsvarande artikel.
Praktiska aspekter av transformation inom molekylärbiologi
Upptäckten av artificiellt inducerad kompetens i bakterier gör att bakterier som Escherichia coli kan användas som en bekväm värd för manipulering av DNA samt för att uttrycka proteiner. Typiskt används plasmider för transformation i E. coli . För att hållas stabilt i cellen måste en plasmid -DNA -molekyl innehålla ett replikationsursprung , vilket gör att den kan replikeras i cellen oberoende av replikationen av cellens egen kromosom.
Effektiviteten med vilken en kompetent kultur kan ta upp exogent DNA och uttrycka dess gener kallas transformationseffektivitet och mäts i kolonibildande enhet (cfu) per μg DNA som används. En transformationseffektivitet av 1 x 10 8 cfu / ig för en liten plasmid som pUC19 motsvarar ungefär 1 i 2000 molekyler av plasmiden som används som transformeras.
Vid kalciumkloridtransformation framställs cellerna genom kylning av celler i närvaro av Ca2+
(i CaCl
2lösning), vilket gör att cellen blir permeabel för plasmid -DNA . Cellerna inkuberas på is med DNA och värmechockas sedan kort (t.ex. vid 42 ° C i 30–120 sekunder). Denna metod fungerar mycket bra för cirkulärt plasmid -DNA. Icke-kommersiella preparat bör normalt ge 10 6 till 10 7 -transformanter per mikrogram plasmid; en dålig beredning kommer att vara cirka 10 4 /μg eller mindre, men en bra beredning av kompetenta celler kan ge upp till ~ 108 kolonier per mikrogram plasmid. Det finns dock protokoll för att göra superkompetenta celler som kan ge en transformationseffektivitet på över 10 9 . Den kemiska metoden fungerar dock vanligtvis inte bra för linjärt DNA, såsom fragment av kromosomalt DNA, troligen för att cellens nativa exonukleasenzymer snabbt bryter ned linjärt DNA. Däremot transformeras celler som är naturligt kompetenta vanligtvis mer effektivt med linjärt DNA än med plasmid -DNA.
Transformationseffektiviteten med hjälp av CaCl
2metoden minskar med plasmidstorlek, och elektroporering kan därför vara en mer effektiv metod för upptag av stort plasmid -DNA. Celler som används vid elektroporering bör först beredas genom att tvätta i kallt dubbeldestillerat vatten för att avlägsna laddade partiklar som kan skapa gnistor under elektroporationsprocessen.
Urval och screening vid plasmidtransformation
Eftersom transformation vanligtvis ger en blandning av relativt få transformerade celler och ett överflöd av icke-transformerade celler, är en metod nödvändig för att välja för cellerna som har förvärvat plasmiden. Plasmiden kräver därför en selekterbar markör så att dessa celler utan plasmiden kan dödas eller få sin tillväxt att stoppas. Antibiotikaresistens är den vanligaste markören för prokaryoter. Den transformerande plasmiden innehåller en gen som ger resistens mot ett antibiotikum som bakterierna annars är känsliga för. Blandningen av behandlade celler odlas på media som innehåller antibiotikumet så att endast transformerade celler kan växa. En annan urvalsmetod är användningen av vissa auxotrofa markörer som kan kompensera för en oförmåga att metabolisera vissa aminosyror, nukleotider eller sockerarter. Denna metod kräver användning av lämpligt muterade stammar som har brist på syntes eller nytta av en viss biomolekyl, och de transformerade cellerna odlas i ett medium som tillåter endast celler som innehåller plasmiden att växa.
I ett kloningsexperiment kan en gen sättas in i en plasmid som används för transformation. I ett sådant experiment kan emellertid inte alla plasmider innehålla en framgångsrikt införd gen. Ytterligare tekniker kan därför användas vidare för att screena för transformerade celler som innehåller plasmid med insatsen. Reportergener kan användas som markörer , såsom lacZ- genen som kodar för β-galaktosidas som används vid blåvit screening . Denna metod för screening bygger på principen om a- komplementation , där ett fragment av lacZ- genen ( lacZα ) i plasmiden kan komplettera en annan mutant lacZ- gen ( lacZΔM15 ) i cellen. Båda generna producerar i sig själva icke-funktionella peptider, men när de uttrycks tillsammans, som när en plasmid innehållande lacZ-a transformeras till en lacZAM15- celler, bildar de ett funktionellt p-galaktosidas. Närvaron av ett aktivt p-galaktosidas kan detekteras när celler odlas i plattor innehållande X-gal , vilket bildar karakteristiska blå kolonier. Emellertid den multipla kloningsstället , där en gen av intresse kan ligeras in i plasmiden vektorn är, som ligger inom lacZa genen. Lyckad ligering stör därför lacZa- genen, och inget funktionellt β-galaktosidas kan bildas, vilket resulterar i vita kolonier. Celler som innehåller framgångsrikt ligerad insats kan sedan lätt identifieras genom dess vita färgning från de misslyckade blåa.
Andra vanliga reportergener är grönt fluorescerande protein (GFP), som producerar celler som lyser grönt under blått ljus och enzymet luciferas , som katalyserar en reaktion med luciferin för att avge ljus. Det rekombinanta DNA kan också detekteras med användning av andra metoder såsom nukleinsyrahybridisering med radioaktiv RNA -sond, medan celler som uttryckte det önskade proteinet från plasmiden också kan detekteras med användning av immunologiska metoder.
Referenser
externa länkar
- Bakteriell transformation (en flashanimation)
- "Redo sikta skjut!" Vid Max Planck-institutet för molekylär växtfysiologi i Potsdam-Golm bombarderas växtceller med hjälp av en partikelpistol