Fotoblekning - Photobleaching

Fotoblekning: Filmen visar fotoblekning av en fluorosfär. Filmen accelereras, hela processen hände under 4 minuter.

I optik är fotoblekning (ibland kallad blekning) den fotokemiska förändringen av ett färgämne eller en fluoroformolekyl så att den permanent inte kan fluorescera. Detta orsakas av klyvning av kovalenta bindningar eller ospecifika reaktioner mellan fluoroforen och omgivande molekyler. Sådana irreversibla modifieringar i kovalenta bindningar orsakas av övergången från ett singletillstånd till triplettillståndet för fluoroforerna. Antalet excitationscykler för att uppnå full blekning varierar. I mikroskopi kan fotoblekning komplicera observationen av fluorescerande molekyler, eftersom de så småningom kommer att förstöras av den ljusexponering som är nödvändig för att stimulera dem till fluorescerande. Detta är särskilt problematiskt vid time-lapse-mikroskopi .

Emellertid kan fotoblekning också användas före applicering av (främst antikroppslänkade ) fluorescerande molekyler, i ett försök att släcka autofluorescens . Detta kan bidra till att förbättra signal-brusförhållandet .

Fotoblekning kan också utnyttjas för att studera rörelser och/eller diffusion av molekyler, till exempel via FRAP , där rörelse av cellulära komponenter kan bekräftas genom att observera en återhämtning av fluorescens på platsen för fotobleaching, eller FLIP -tekniker, där flera rundor av fotoblekning görs så att spridningen av fluorescensförlust kan observeras i cellen.

Förlust av aktivitet som orsakas av fotoblekning kan kontrolleras genom att minska ljusexponeringens intensitet eller tidsperiod, genom att öka koncentrationen av fluoroforer, genom att minska frekvensen och därmed fotonenergin för ingångsljuset eller genom att använda mer robusta fluoroforer som är mindre benägna att bleka (t.ex. cyaninfärgämnen, Alexa Fluors eller DyLight Fluors , AttoDyes, Janelia Dyes och andra). Till en rimlig approximation kommer en given molekyl att förstöras efter en konstant exponering (intensitet av emission X-emissionstid X antal cykler) eftersom varje absorption-emissionscykel i en konstant miljö har lika stor sannolikhet att orsaka fotoblekning.

Fotoblekning är en viktig parameter att ta hänsyn till i realtid med enmolekylär fluorescensavbildning i biofysik. Vid ljusintensiteter som används vid enmolekylär fluorescensavbildning (0,1-1 kW/cm2 i typiska experimentella inställningar) fortsätter även de flesta robusta fluoroforer att avge i upp till 10 sekunder innan fotoblekning i ett enda steg. För vissa färgämnen kan livslängden förlängas 10-100 gånger med hjälp av syrgasavlägsnande system (upp till 1000 sekunder med optimering av avbildningsparametrar och signal-till-brus). Till exempel används en kombination av Protocatechuic acid (PCA) och protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) ofta som syreuppsamlingssystem, och det ökar livstiden för fluorescens med mer än en minut.

Beroende på deras specifika kemi kan molekyler fotbleka efter att ha absorberat bara några fotoner, medan mer robusta molekyler kan genomgå många absorptions-/utsläppscykler innan de förstörs:

  • Grönt fluorescerande protein : 10 4 -10 5 fotoner; 0,1–1,0 sekunders livstid.
  • Typisk organiskt färgämne: 10 5 -10 6 fotoner; 1–10 sekunders livstid.
  • CdSe / ZnS quantum dot : 10 8 fotoner; > 1000 sekunder livstid.

Denna användning av termen "livstid" ska inte förväxlas med "livstid" mätt med fluorescens livstidsavbildning .

Se även

Referenser

externa länkar

  • Introduktion till optisk mikroskopi en artikel om fotoblekning
  • Viegas MS; Martins TC; Seco F; gör Carmo A (2007). "En förbättrad och kostnadseffektiv metod för minskning av autofluorescens i direkta immunfluorescensstudier på formalinfixerade paraffininbäddade vävnader". Eur J Histochem . 51 (1): 59–66. PMID  17548270 .