Knockout mus - Knockout mouse

En knockout-mus , eller knock-out-mus , är en genetiskt modifierad mus ( Mus musculus ) där forskare har inaktiverat, eller " slagit ut ", en befintlig gen genom att ersätta den eller störa den med en artificiell bit av DNA . De är viktiga djurmodeller för att studera rollen för gener som har sekvenserats men vars funktioner inte har fastställts. Genom att få en specifik gen att vara inaktiv i musen och observera eventuella skillnader från normalt beteende eller fysiologi, kan forskare utläsa dess troliga funktion.

Möss är för närvarande de laboratoriedjurarter som är närmast släkt med människor för vilka knockout -tekniken enkelt kan tillämpas. De används ofta i knockout -experiment, särskilt de som undersöker genetiska frågor som rör mänsklig fysiologi . Gen knockout hos råttor är mycket svårare och har bara varit möjligt sedan 2003.

Den första inspelade knockout -musen skapades av Mario R. Capecchi , Martin Evans och Oliver Smithies 1989, för vilka de tilldelades 2007 Nobelpriset i fysiologi eller medicin . Aspekter av tekniken för att generera knockout -möss, och mössen själva har patenterats i många länder av privata företag.

Använda sig av

En laboratoriemus där en gen som påverkar hårväxt har slagits ut (vänster) visas bredvid en normal labmus.

Att slå ut genens aktivitet ger information om vad den genen normalt gör. Människor delar många gener med möss. Följaktligen ger observationer av egenskaperna hos knockout -möss forskare information som kan användas för att bättre förstå hur en liknande gen kan orsaka eller bidra till sjukdom hos människor.

Exempel på forskning där knockout -möss har varit användbara inkluderar att studera och modellera olika typer av cancer , fetma , hjärtsjukdomar , diabetes , artrit , missbruk , ångest , åldrande och Parkinsons sjukdom . Knockout -möss erbjuder också ett biologiskt och vetenskapligt sammanhang där läkemedel och andra terapier kan utvecklas och testas.

Miljoner knockout -möss används i experiment varje år.

Stammar

En knockout -mus (vänster) som är en modell för fetma, jämfört med en vanlig mus.

Det finns flera tusen olika stammar av knockout -möss. Många musmodeller är uppkallade efter genen som har inaktiverats. Till exempel är p53 -knockout -musen uppkallad efter p53 -genen som kodar för ett protein som normalt undertrycker tillväxten av tumörer genom att stoppa celldelning och/eller inducera apoptos. Människor födda med mutationer som avaktiverar p53-genen lider av Li-Fraumeni syndrom , ett tillstånd som dramatiskt ökar risken för att utveckla bencancer, bröstcancer och blodcancer i tidig ålder. Andra musmodeller heter efter deras fysiska egenskaper eller beteenden.

Procedur

Förfarandet för att göra blastocyst blandad genotyp.
Avelsschema för att producera knockout -möss. Blastocyster innehållande celler, som är både vildtyp- och knockoutceller, injiceras i livmodern hos en fostermamma. Detta producerar avkommor som antingen är vildtyp och färgade i samma färg som blastocystdonatorn (grå) eller kimäran (blandad) och delvis utslagna. Kimärmössen korsas med en normal vildtypmus (grå). Detta producerar avkommor som antingen är vita och heterozygota för den utslagen genen eller grå och vildtyp. Vita heterozygota möss kan därefter korsas för att producera möss som är homozygota för den utslagna genen.

Det finns flera variationer av förfarandet för att producera knockout -möss; följande är ett typiskt exempel.

  1. Genen som ska slås ut isoleras från ett musgenbibliotek . Därefter konstrueras en ny DNA -sekvens som är mycket lik den ursprungliga genen och dess närmaste grannsekvens, förutom att den ändras tillräckligt för att göra genen inoperabel. Vanligtvis ges den nya sekvensen också en markörgen , en gen som normala möss inte har och som ger resistens mot ett visst toxiskt ämne (t.ex. neomycin) eller som ger en observerbar förändring (t.ex. färg eller fluorescens). Dessutom ingår en andra gen, såsom herpes tk+, i konstruktionen för att åstadkomma ett fullständigt urval.
  2. Embryonala stamceller isoleras från en musblastocyst (ett mycket ungt embryo ) och odlas in vitro . I det här exemplet tar vi stamceller från en vit mus.
  3. Den nya sekvensen från steg 1 införs i stamcellerna från steg 2 genom elektroporering . Genom den naturliga processen med homolog rekombination kommer några av de elektroporerade stamcellerna att införliva den nya sekvensen med den utslagna genen i sina kromosomer i stället för den ursprungliga genen. Chanserna för en lyckad rekombinationshändelse är relativt låga, så majoriteten av förändrade celler kommer att ha den nya sekvensen i endast en av de två relevanta kromosomerna - de sägs vara heterozygota . Celler som transformerades med en vektor innehållande neomycinresistensgenen och herpes tk+ -genen odlas i en lösning innehållande neomycin och Ganciclovir för att selektera för de transformationer som skedde via homolog rekombination. Varje insättning av DNA som skedde via slumpmässig insättning kommer att dö eftersom de testar positivt för både neomycinresistensgenen och herpes tk+ -genen, vars genprodukt reagerar med Ganciclovir för att producera ett dödligt toxin. Dessutom testar celler som inte integrerar något av det genetiska materialet negativa för båda generna och dör därför som ett resultat av förgiftning med neomycin.
  4. De embryonala stamcellerna som införlivade den utslagna genen isoleras från de oförändrade cellerna med användning av markörgenen från steg 1. Till exempel kan de oförändrade cellerna dödas med hjälp av ett toxiskt medel mot vilket de förändrade cellerna är resistenta.
  5. De utslagna embryonala stamcellerna från steg 4 införs i en musblastocyst . I det här exemplet använder vi blastocyster från en grå mus. Blastocysterna innehåller nu två typer av stamceller: de ursprungliga (från den grå musen) och de utslagna cellerna (från den vita musen). Dessa blastocyster implanteras sedan i livmodern hos honmöss, där de utvecklas. De nyfödda mössen kommer därför att vara chimärer : vissa delar av deras kroppar kommer från de ursprungliga stamcellerna, andra delar från de utslagna stamcellerna. Deras päls kommer att visa fläckar av vitt och grått, med vita fläckar som härrör från de utslagna stamcellerna och grå fläckar från mottagarblastocysten.
  6. Några av de nyfödda kimärmössen kommer att ha könskörtlar härrörande från utslagna stamceller och kommer därför att producera ägg eller spermier som innehåller den utslagna genen. När dessa kimärmöss korsas med andra av vildtyp kommer några av deras avkommor att ha en kopia av den utslagna genen i alla sina celler. Dessa möss behåller inget grått mus -DNA och är inte kimärer, men de är fortfarande heterozygota.
  7. När dessa heterozygota avkommor blandas in kommer några av deras avkommor att ärva den utslagna genen från båda föräldrarna; de bär ingen funktionell kopia av den ursprungliga oförändrade genen (dvs de är homozygota för den allelen).

En detaljerad förklaring av hur knockout -möss (KO) skapas finns på webbplatsen för Nobelpriset i fysiologi eller medicin 2007.

Begränsningar

National Institutes of Health diskuterar några viktiga begränsningar av denna teknik.

Medan knockout -musteknologi representerar ett värdefullt forskningsverktyg, finns det några viktiga begränsningar. Ungefär 15 procent av gen -knockouts är utvecklingsdödliga, vilket innebär att de genetiskt förändrade embryona inte kan växa till vuxna möss. Detta problem övervinns ofta genom användning av villkorliga mutationer . Bristen på vuxna möss begränsar studier till embryonal utveckling och gör det ofta svårare att bestämma en genens funktion i förhållande till människors hälsa . I vissa fall kan genen tjäna en annan funktion hos vuxna än vid utveckling av embryon.

Att slå ut en gen kan också misslyckas med att producera en observerbar förändring hos en mus eller till och med producera andra egenskaper än de som observerats hos människor där samma gen är inaktiverad. Till exempel är mutationer i p53 -genen associerade med mer än hälften av mänskliga cancerformer och leder ofta till tumörer i en viss uppsättning vävnader. Men när p53 -genen slås ut hos möss utvecklar djuren tumörer i en annan uppsättning vävnader.

Det finns variation i hela förfarandet beroende till stor del på den stam från vilken stamcellerna har härletts. I allmänhet används celler härledda från stam 129. Denna specifika stam är inte lämplig för många experiment (t.ex. beteendemässiga), så det är mycket vanligt att backcrossa avkomman till andra stammar. Vissa genomiska loci har visat sig vara mycket svåra att slå ut. Orsaker kan vara förekomsten av repetitiva sekvenser, omfattande DNA -metylering eller heterokromatin . Den förvirrande närvaron av närliggande 129 gener på knockout-segmentet av genetiskt material har kallats "flank-gen-effekten". Metoder och riktlinjer för att hantera detta problem har föreslagits.

En annan begränsning är att konventionella (dvs. icke-villkorliga) knockout-möss utvecklas i frånvaro av genen som undersöks. Ibland kan förlust av aktivitet under utveckling maskera genens roll i det vuxna tillståndet, särskilt om genen är involverad i många processer som spänner över utveckling. Villkorliga/inducerbara mutationsmetoder krävs sedan som först låter musen utvecklas och mogna normalt före ablation av genen av intresse.

En annan allvarlig begränsning är bristen på evolutiva anpassningar i knockout -modellen som kan uppstå hos vildtypsdjur efter att de naturligt muterat. Till exempel utgör erytrocytspecifik samuttryck av GLUT1 med stomatin en kompensationsmekanism hos däggdjur som inte kan syntetisera C-vitamin .

Se även

Referenser

externa länkar