Inducerade stamceller - Induced stem cells

Inducerade stamceller ( iSC ) är stamceller härledda från somatiska , reproduktiva , pluripotenta eller andra celltyper genom avsiktlig epigenetisk omprogrammering. De klassificeras som antingen totipotent (iTC), pluripotent (iPSC) eller progenitor (multipotent - iMSC, även kallad en inducerad multipotent progenitorcell - iMPC) eller unipotent - (iUSC) beroende på deras utvecklingspotential och grad av dedifferentiering . Avkommor erhålls genom så kallad direkt omprogrammering eller riktad differentiering och kallas också inducerade somatiska stamceller .

Tre tekniker är allmänt kända:

• Transplantation av kärnor som tas från somatiska celler till en äggcell (äggcell) som saknar sin egen kärna (avlägsnas i laboratoriet)
• Fusion av somatiska celler med pluripotenta stamceller och
• Transformation av somatiska celler till stamceller, med användning av det genetiska materialet som kodar för omprogrammering av proteinfaktorer , rekombinanta proteiner; microRNA, ett syntetiskt, självreplikerande polykistroniskt RNA och biologiskt aktiva ämnen med låg molekylvikt.

Naturliga processer

År 1895 tog Thomas Morgan bort en av en grodas två blastomerer och fann att amfibier kan bilda hela embryon från den återstående delen. Detta innebar att cellerna kan ändra sin differentieringsväg. År 1924 demonstrerade Spemann och Mangold nyckelvikten av cell -cellinduktioner under utveckling av djur. Den reversibla transformationen av celler av en differentierad celltyp till en annan kallas metaplasi . Denna övergång kan vara en del av den normala mognadsprocessen eller orsakas av en stimulans.

Ett exempel är omvandlingen av iris celler till linsceller i processen för mognad och transformation av retinala pigmentepitel -celler i den neurala näthinnan under regenerering hos vuxna vattenödle ögon. Denna process gör att kroppen kan ersätta celler som inte är lämpliga för nya förhållanden med mer lämpliga nya celler. I Drosophila imaginella skivor måste cellerna välja mellan ett begränsat antal standard diskreta differentieringstillstånd. Det faktum att transbestämning (förändring av differentieringsvägen) ofta sker för en grupp celler snarare än enstaka celler visar att den induceras snarare än en del av mognad.

Forskarna kunde identifiera de minimala förhållanden och faktorer som skulle vara tillräckliga för att starta kaskaden av molekylära och cellulära processer för att instruera pluripotenta celler att organisera embryot . De visade att motsatta gradienter av benmorfogenetiskt protein (BMP) och Nodal , två transformerande tillväxtfaktor familjemedlemmar som fungerar som morfogener krävs, är tillräckliga för att inducera molekylära och cellulära mekanismer för att organisera, in vivo eller in vitro , obekräftade celler i zebrafisk blastula djurstång till ett väl utvecklat embryo .

Vissa typer av mogna, specialiserade vuxna celler kan naturligtvis återgå till stamceller. Till exempel uttrycker "chef" -celler stamcellmarkören Troy. Medan de normalt producerar matsmältningsvätskor för magen, kan de återgå till stamceller för att göra tillfälliga reparationer av magskador, till exempel ett snitt eller skada från infektion. Dessutom kan de göra denna övergång även i avsaknad av märkbara skador och kan fylla på hela mag -enheter, i huvudsak fungera som vilande "reserv" stamceller. Differentierade luftvägsepitelceller kan återgå till stabila och funktionella stamceller in vivo . Efter skada, mogna terminalt differentierade njurceller differentieras till mer ursprungliga versioner av sig själva och differentieras sedan till de celltyper som behöver ersättas i den skadade vävnaden Makrofager kan självförnyas genom lokal spridning av mogna differentierade celler. Hos newts regenereras muskelvävnad från specialiserade muskelceller som dedifferentierar och glömmer vilken celltyp de hade varit. Denna förmåga att regenerera minskar inte med åldern och kan vara kopplad till deras förmåga att skapa nya stamceller från muskelceller på begäran.

En mängd icke -tumörogena stamceller visar förmågan att generera flera celltyper. Till exempel är multilineage-differentierande stressbeständiga (Muse) celler stress-toleranta vuxna mänskliga stamceller som kan förnya sig själv. De bildar karakteristiska cellkluster i suspensionskultur som uttrycker en uppsättning gener associerade med pluripotens och kan differentieras till endodermala , ektodermala och mesodermala celler både in vitro och in vivo.

Andra väldokumenterade exempel på transdifferentiering och deras betydelse för utveckling och regenerering beskrevs i detalj.

Inducerade totipotenta celler kan vanligtvis erhållas genom omprogrammering av somatiska celler genom somatisk cellkärnöverföring (SCNT).

Framkallade totipotenta celler

SCNT-medierad

Inducerade totipotenta celler kan erhållas genom omprogrammering av somatiska celler med somatisk cellkärnöverföring (SCNT). Processen går ut på att suga ut kärnan i en somatisk (kropps) cell och injicera den i en oocyt som har fått sin kärna borttagen

Med hjälp av ett tillvägagångssätt baserat på protokollet som beskrivs av Tachibana et al., Kan hESCs genereras av SCNT med hjälp av dermal fibroblastkärnor från både en medelålders 35-årig man och en äldre, 75-årig man, vilket tyder på den åldern -associerade förändringar är inte nödvändigtvis ett hinder för SCNT-baserad nukleär omprogrammering av mänskliga celler. Sådan omprogrammering av somatiska celler till ett pluripotent tillstånd har stora potentialer för regenerativ medicin . Tyvärr är de celler som genereras av denna teknik potentiellt inte helt skyddade från patientens immunsystem (donator av kärnor), eftersom de har samma mitokondriella DNA, som en donator av oocyter, istället för patientens mitokondriella DNA. Detta minskar deras värde som källa för autolog stamcellstransplantationsterapi ; som för närvarande är det inte klart om det kan inducera ett immunsvar hos patienten vid behandling.

Inducerade androgenetiska haploida embryonala stamceller kan användas istället för spermier för kloning. Dessa celler, synkroniserade i M -fas och injicerade i äggcellen, kan producera livskraftiga avkommor.

Denna utveckling, tillsammans med data om möjligheten för obegränsade oocyter från mitotiskt aktiva reproduktiva stamceller, ger möjlighet till industriell produktion av transgena husdjur. Upprepad rekloning av livskraftiga möss genom en SCNT -metod som inkluderar en histondeacetylashämmare , trikostatin, tillsatt till cellodlingsmediet, visar att det kan vara möjligt att reclone djur på obestämd tid utan synlig ackumulering av omprogrammering eller genomfel. Men forskning om teknik för att utveckla spermier och äggceller från stamceller väcker bioetiska problem.

Sådan teknik kan också ha långtgående kliniska tillämpningar för att övervinna cytoplasmatiska defekter i mänskliga oocyter. Till exempel kan tekniken förhindra att ärftlig mitokondriell sjukdom övergår till kommande generationer. Mitokondriellt genetiskt material överförs från mor till barn. Mutationer kan orsaka diabetes, dövhet, ögonsjukdomar, gastrointestinala störningar, hjärtsjukdomar, demens och andra neurologiska sjukdomar. Kärnan från ett mänskligt ägg har överförts till ett annat, inklusive mitokondrier, vilket skapat en cell som kan anses ha två mödrar. Äggen befruktades sedan och de resulterande embryonala stamcellerna bar det byttade mitokondriella DNA: t. Som bevis på att tekniken är säker, pekar författaren till denna metod på förekomsten av de friska apor som nu är mer än fyra år gamla - och är en produkt av mitokondriella transplantationer med olika genetiska bakgrunder.

Hos sengenererade telomerasbristande (Terc-/-) möss mildrar SCNT-medierad omprogrammering telomerdysfunktion och mitokondriella defekter i större utsträckning än iPSC-baserad omprogrammering.

Andra kloning och totipotenta transformationsprestationer har beskrivits.

Erhållet utan SCNT

Nyligen lyckades några forskare få totipotenta celler utan hjälp av SCNT. Totipotenta celler erhölls med användning av epigenetiska faktorer, såsom oocyt -germinal isoform av histon. Omprogrammering in vivo, genom övergående induktion av de fyra faktorerna Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc hos möss, ger totipotensegenskaper. Intraperitoneal injektion av sådana in vivo iPS-celler genererar embryoliknande strukturer som uttrycker embryonala och extraembryonala ( trofektodermala ) markörer. Utvecklingspotentialen hos musens pluripotenta stamceller för att ge både embryonala och extra-embryonala släktlinjer kan också expanderas med mikroRNA miR-34a- brist, vilket leder till stark induktion av endogena retrovirus MuERV-L (MERVL).

Föryngring till iPSC

Transplantation av pluripotenta/embryonala stamceller i vuxna däggdjurs kropp leder vanligtvis till bildandet av teratom , som sedan kan övergå till ett malignt tumörteratokarcinom. Att sätta teratokarcinomceller i embryot på blastocyststadiet fick dem dock att bli införlivade i cellmassan och producerade ofta ett normalt friskt chimärt (dvs sammansatt av celler från olika organismer) djur

iPSc erhölls först i form av transplanterbart teratokarcinom inducerat av transplantat tagna från musembryon. Teratokarcinom bildat av somatiska celler. Genetiskt mosaikmöss erhölls från maligna teratokarcinomceller, vilket bekräftade cellernas pluripotens. Det visade sig att teratokarcinomceller kan upprätthålla en kultur av pluripotenta embryonala stamceller i ett odifferentierat tillstånd genom att förse odlingsmediet med olika faktorer. På 1980 -talet blev det klart att transplantering av pluripotenta/embryonala stamceller i kroppen hos vuxna däggdjur vanligtvis leder till bildning av teratom , som sedan kan övergå till ett malignt tumörteratokarcinom. Att sätta teratokarcinomceller i embryot vid blastocyststadiet fick dem emellertid att införlivas i den inre cellmassan och producerade ofta ett normalt chimärt (dvs sammansatt av celler från olika organismer) djur. Detta indikerade att orsaken till teratom är en dissonans - ömsesidig felkommunikation mellan unga donatorceller och omgivande vuxna celler (mottagarens så kallade " nisch ").

I augusti 2006 kringgick japanska forskare behovet av en oocyt, som i SCNT. Genom att omprogrammera musens embryonala fibroblaster till pluripotenta stamceller via ektopiskt uttryck för fyra transkriptionsfaktorer , nämligen Oct4 , Sox2 , Klf4 och c-Myc , bevisade de att överuttryck av ett litet antal faktorer kan driva cellen till övergång till ett nytt stabilt tillstånd som är associerat med förändringar i aktiviteten hos tusentals gener.

Mänskliga somatiska celler görs pluripotenta genom att transducera dem med faktorer som inducerar pluripotens (OCT 3/4, SOX2, Klf4, c-Myc, NANOG och LIN28). Detta resulterar i produktion av IPS -celler, som kan differentieras till vilken cell som helst av de tre embryonala groddskikten (Mesoderm, Endoderm, Ectoderm).

Omprogrammeringsmekanismer är således länkade, snarare än oberoende, och är centrerade på ett litet antal gener. IPSC -egenskaper liknar mycket ESC. iPSC har visat sig stödja utvecklingen av alla iPSC-möss med hjälp av ett tetraploid (4n) embryo, den strängaste analysen för utvecklingspotential. Vissa genetiskt normala iPSC misslyckades dock med att producera all-iPSC-möss på grund av avvikande epigenetisk tystnad av det präglade Dlk1-Dio3- genklustret. Ett team under ledning av Hans Schöler (som upptäckte Oct4-genen 1989) visade att Oct4-överuttryck driver massiv genaktivering utanför målet under omprogrammering försämrar kvaliteten på iPSC: er. Jämfört med OSKM (4 oktober, Sox2, Klf4 och c-Myc) som visar onormala präglings- och differentieringsmönster genererar SKM (Sox2, Klf4 och c-Myc) omprogrammering iPSC: er med hög utvecklingspotential (nästan 20 gånger högre än OSKM) ekvivalent med embryonala stamceller , bestämt av deras förmåga att generera all-iPSC-möss genom tetraploid embryokomplementering.

En viktig fördel med iPSC framför ESC är att de kan härledas från vuxna celler, snarare än från embryon. Därför blir det möjligt att få iPSC från vuxna och till och med äldre patienter.

Omprogrammering av somatiska celler till iPSC leder till föryngring. Det visade sig att omprogrammering leder till förlängning av telomer och efterföljande förkortning efter deras differentiering tillbaka till fibroblastliknande derivat. Således leder omprogrammering till återställandet av den embryonala telomerlängden och ökar därmed det potentiella antalet celldelningar som annars begränsas av Hayflick -gränsen .

På grund av dissonansen mellan föryngrade celler och den omgivande nischen hos mottagarens äldre celler, leder injektionen av hans egen iPSC vanligtvis till ett immunsvar , som kan användas för medicinska ändamål, eller bildandet av tumörer som teratom. En hypotetiserad orsak är att vissa celler som skiljer sig från ESC och iPSCs in vivo fortsätter att syntetisera embryonala proteinisoformer . Så kan immunsystemet upptäcka och attackera celler som inte samarbetar ordentligt.

En liten molekyl som heter MitoBloCK-6 kan tvinga de pluripotenta stamcellerna att dö genom att utlösa apoptos (via cytokrom c- frisättning över mitokondriellt yttre membran) i mänskliga pluripotenta stamceller, men inte i differentierade celler. Kort efter differentiering blev dotterceller resistenta mot döden. När MitoBloCK-6 introducerades för differentierade cellinjer förblev cellerna friska. Nyckeln till deras överlevnad antogs bero på de förändringar som genomgick av pluripotenta stamcells mitokondrier i celldifferentieringsprocessen. Denna förmåga hos MitoBloCK-6 att separera de pluripotenta och differentierade cellinjerna har potential att minska risken för teratom och andra problem inom regenerativ medicin.

Under 2012 identifierades andra små molekyler (selektiva cytotoxiska hämmare av humana pluripotenta stamceller - hPSC) som hindrade mänskliga pluripotenta stamceller från att bilda teratom i möss. Den mest potenta och selektiva föreningen av dem (PluriSIn #1) hämmar stearoyl-coA-desaturas (nyckelenzym i oljesyrabiosyntes ), vilket slutligen resulterar i apoptos. Med hjälp av denna molekyl kan de odifferentierade cellerna selektivt avlägsnas från odlingen. En effektiv strategi för att selektivt eliminera pluripotenta celler med teratom potential riktar pluripotent stamcell specifik antiapoptotiska faktor (er) (dvs, survivin eller Bcl10). En enda behandling med kemiska survivinhämmare (t.ex. quercetin eller YM155) kan inducera selektiv och fullständig celldöd av odifferentierade hPSC: er och påstås vara tillräcklig för att förhindra bildning av teratom efter transplantation. Det är dock osannolikt att någon form av preliminärt godkännande kan säkra omplanteringen av iPSC eller ESC. Efter det selektiva avlägsnandet av pluripotenta celler återkommer de snabbt genom att omvandla differentierade celler till stamceller, vilket leder till tumörer. Detta kan bero på den störning i låt-7 reglering av sitt mål Nr6a1 (även känd som i könsceller nukleär faktor - GCNF), en embryonal transkriptions repressor av pluripotensbestämmande gener som reglerar genuttryck i vuxna fibroblaster efter mikro-RNA miRNA förlust.

Teratombildning av pluripotenta stamceller kan orsakas av låg aktivitet av PTEN-enzym , som rapporterats främja överlevnad för en liten befolkning (0,1–5% av den totala befolkningen) av mycket tumorigena, aggressiva, teratominitierande embryonliknande karcinomceller under differentiering . Överlevnaden av dessa teratom-initierande celler är förknippad med misslyckad undertryckande av Nanog , liksom en benägenhet för ökad glukos- och kolesterolmetabolism. Dessa teratom-initierande celler uttryckte också ett lägre förhållande av p53/p21 jämfört med icke-tumorigena celler. I samband med ovanstående säkerhetsproblem är användningen av iPSC för cellterapi fortfarande begränsad. De kan dock användas för en mängd andra ändamål, inklusive modellering av sjukdomar, screening (selektivt urval) av läkemedel och toxicitetstestning av olika läkemedel.

Små molekylmodulatorer för stamcells öde.

Vävnaden som odlats från iPSC, placerad i de "chimära" embryona i de tidiga stadierna av musutveckling, orsakar praktiskt taget inte ett immunsvar (efter att embryona har vuxit till vuxna möss) och är lämpliga för autolog transplantation Samtidigt full omprogrammering av vuxna celler in vivo i vävnader genom övergående induktion av de fyra faktorerna Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc i möss resulterar i att teratom kommer från flera organ. Vidare visar partiell omprogrammering av celler mot pluripotens in vivo hos möss att ofullständig omprogrammering medför epigenetiska förändringar (misslyckad repression av Polycomb -mål och förändrad DNA -metylering ) i celler som driver cancerutveckling. Ett antal forskare lyckades emellertid senare genomföra cyklisk partiell omprogrammering in vivo genom uttryck av Yamanaka -faktorerna under en kort tidsperiod utan efterföljande cancerframkallande, vilket delvis föryngrade och förlängde livslängden hos progeroidmöss. Med in vitro -metod som använder något längre perioder av omprogrammering (för att väsentligt föryngra) förlorar cellerna tillfälligt sin cellidentitet men "förvärvar sitt ursprungliga somatiska öde när omprogrammeringsfaktorerna dras tillbaka".

Cellodlingsexempel på en liten molekyl som ett verktyg istället för ett protein. i cellkultur för att erhålla en pankreatisk härstamning från mesodermala stamceller den retinsyra signalväg måste aktiveras under det att sonic hedgehog -vägen inhiberas, vilket kan göras genom att till de medier anti shh antikroppar , Hedgehog interagerande protein eller cyklop - det första två är proteiner och den sista en liten molekyl.

Kemisk inducering

Genom att använda enbart små molekyler demonstrerade Deng Hongkui och kollegor att endogena "mastergener" räcker för omprogrammering av cellöden. De inducerade ett pluripotent tillstånd i vuxna celler från möss med användning av sju småmolekylföreningar. Metodens effektivitet är ganska hög: den kunde omvandla 0,02% av de vuxna vävnadscellerna till iPSC, vilket är jämförbart med geninsättningsomvandlingsfrekvensen. Författarna noterar att mössen som genererades från CiPSCs var "100% livskraftiga och tydligen friska i upp till 6 månader". Så denna kemiska omprogrammeringsstrategi har potentiell användning för att generera funktionella önskvärda celltyper för kliniska tillämpningar.

År 2015 inrättades ett robust kemiskt omprogrammeringssystem med ett avkastning upp till 1000 gånger större än det tidigare rapporterade protokollet. Så kemisk omprogrammering blev ett lovande tillvägagångssätt för att manipulera cellöden.

Differentiering från inducerat teratom

Det faktum att mänskliga iPSC: er kan bilda teratom, inte bara hos människor utan även i vissa djurkroppar, i synnerhet möss eller grisar, gjorde det möjligt för forskare att utveckla en metod för differentiering av iPSCs in vivo. För detta ändamål injiceras iPSC med ett medel för att inducera differentiering till målceller till en genetiskt modifierad gris eller mus som har undertryckt immunsystemets aktivering på mänskliga celler. Det bildade teratom skärs ut och används för isolering av nödvändiga differentierade humana celler med hjälp av monoklonal antikropp mot vävnadsspecifika markörer på ytan av dessa celler. Denna metod har framgångsrikt använts för produktion av funktionella myeloid-, erytroid- och lymfoida humana celler som är lämpliga för transplantation (ännu bara till möss). Möss graverade med humana iPSC-teratom-härledda hematopoetiska celler producerade humana B- och T-celler med funktionella immunsvar. Dessa resultat ger hopp om att in vivo -generation av patientanpassade celler är genomförbar, vilket ger material som kan vara användbara för transplantation, human antikroppsgenerering och läkemedelsscreeningsapplikationer. Med MitoBloCK-6 och/eller PluriSIn # 1 kan de differentierade stamcellerna renas ytterligare från teratombildande pluripotenta celler. Det faktum att differentieringen äger rum även i teratomnischen ger hopp om att de resulterande cellerna är tillräckligt stabila för att stimuli kan orsaka deras övergång tillbaka till det dedifferentierade (pluripotenta) tillståndet och därför säkra. Ett liknande in vivo-differentieringssystem, som ger engraftabla hematopoetiska stamceller från mus- och humana iPSC i teratombärande djur i kombination med en manöver för att underlätta hematopoies, beskrivs av Suzuki et al. De noterade att varken leukemi eller tumörer observerades hos mottagare efter intravenös injektion av iPSC-härledda hematopoetiska stamceller i bestrålade mottagare. Dessutom resulterade denna injektion i multilineage och långsiktig rekonstitution av det hematolymfopoetiska systemet vid serieöverföringar. Ett sådant system tillhandahåller ett användbart verktyg för praktisk tillämpning av iPSC vid behandling av hematologiska och immunologiska sjukdomar.

För vidare utveckling av denna metod måste djur (såsom möss) i vilka den mänskliga celltransplantationen odlas ha modifierat genom så att alla dess celler uttrycker och har på sin yta mänskligt SIRPa . För att förhindra avstötning efter transplantation till patienten av det allogena organet eller vävnaden, odlad från de pluripotenta stamcellerna in vivo i djuret, bör dessa celler uttrycka två molekyler: CTLA4-Ig , som stör T-cellens kostimulatoriska vägar och PD-L1 , vilket aktiverar T -cellinhiberande väg.

Se även: US 20130058900  patent.

Differentierade celltyper

Retinala celler

Inom en snar framtid kommer kliniska prövningar avsedda att demonstrera säkerheten vid användning av iPSC för cellterapi för personer med åldersrelaterad makuladegeneration, en sjukdom som orsakar blindhet genom skador på näthinnan. Det finns flera artiklar som beskriver metoder för att producera näthinneceller från iPSC och hur man använder dem för cellterapi. Rapporter om iPSC-härledd retinalpigmenterad epiteltransplantation visade förbättrat visuellt styrt beteende hos försöksdjur i 6 veckor efter transplantation. Men kliniska prövningar har varit framgångsrika: tio patienter som lider av retinitis pigmentosa har fått synen återställd, inklusive en kvinna som bara hade 17 procent av sin syn kvar.

Lung- och luftvägsepitelceller

Kroniska lungsjukdomar, såsom idiopatisk lungfibros och cystisk fibros eller kronisk obstruktiv lungsjukdom och astma , är ledande orsaker till sjuklighet och dödlighet över hela världen, med en avsevärd mänsklig, samhällelig och ekonomisk börda. Därför finns det ett akut behov av en effektiv cellterapi och lungvävnadsteknik . Flera protokoll har utvecklats för generering av de flesta celltyper i andningsorganen , vilket kan vara användbart för att härleda patientspecifika terapeutiska celler.

Fortplantningsceller

Vissa rader av iPSC har potential att differentieras till manliga könsceller och oocytliknande celler i en lämplig nisch (genom odling i retinsyra och follikeldifferentieringsmedium från gris eller transplantation av seminiferous tubuli). Dessutom bidrar iPSC -transplantation till att reparera testiklarna hos infertila möss, vilket visar potentialen för gameterivation från iPSCs in vivo och in vitro.

Framkallade stamceller från stamfäder

Direkt transdifferentiering

Risken för cancer och tumörer skapar behovet av att utveckla metoder för säkrare cellinjer som är lämpliga för klinisk användning. Ett alternativt tillvägagångssätt är så kallad "direkt omprogrammering"-transdifferentiering av celler utan att passera genom pluripotent tillstånd. Grunden för detta tillvägagångssätt var att 5-azacytidin- ett DNA-demetyleringsreagens-kan orsaka bildning av myogena , kondrogena och adipogeni-kloner i en odödlig cellinje av mus embryonala fibroblaster och att aktivering av en enda gen, senare benämnd MyoD1, är tillräcklig för sådan omprogrammering. Jämfört med iPSC vars omprogrammering kräver minst två veckor, uppstår bildandet av inducerade stamceller ibland inom några dagar och effektiviteten av omprogrammering är vanligtvis många gånger högre. Denna omprogrammering kräver inte alltid celldelning. Cellerna som härrör från sådan omprogrammering är mer lämpliga för cellterapi eftersom de inte bildar teratom. Till exempel beskriver Chandrakanthan et al., & Pimanda genereringen av vävnadsregenerativa multipotenta stamceller (iMS-celler) genom att behandla mogna ben- och fettceller övergående med en tillväxtfaktor ( trombocyt-härledd tillväxtfaktor –AB (PDGF-AB)) och 5-Azacytidin. Dessa författare säger att "Till skillnad från primära mesenkymala stamceller, som används med få objektiva bevis i klinisk praxis för att främja vävnadsreparation, bidrar iMS-celler direkt till in vivo vävnadsregenerering på ett kontextberoende sätt utan att bilda tumörer" och därmed "har betydande utrymme för tillämpning vid vävnadsregenerering ".

Enstaka transkriptionsfaktortransdifferentiering

Ursprungligen kunde endast tidiga embryonala celler lockas till att ändra sin identitet. Mogna celler är resistenta mot att ändra sin identitet när de har förbundit sig till ett visst slag. Ett kort uttryck för en enda transkriptionsfaktor, ELT-7 GATA-faktorn, kan emellertid omvandla identiteten hos fullständigt differentierade, specialiserade icke-endodermala celler i svalget till fullt differentierade tarmceller hos intakta larver och vuxen rundmask Caenorhabditis elegans utan krav på en dedifferentierad mellanprodukt.

Transdifferentiering med CRISPR-medierad aktivator

Cellens öde kan effektivt manipuleras genom epigenomredigering , särskilt genom direkt aktivering av specifikt endogent genuttryck med CRISPR -medierad aktivator. När dCas9 (som har modifierats så att det inte längre skär DNA, men ändå kan vägledas till specifika sekvenser och att binda till dem) kombineras med transkriptionsaktivatorer, kan det exakt manipulera endogent genuttryck. Med hjälp av denna metod förbättrade Wei et al. Uttrycket av endogena Cdx2- och Gata6- gener med CRISPR-medierade aktivatorer, vilket direkt konverterade musens embryonala stamceller till två extraembryoniska linjer, dvs typiska trofoblast-stamceller och extraembryonala endodermceller. Ett analogt tillvägagångssätt användes för att inducera aktivering av de endogena Brn2-, Ascl1- och Mytl -generna för att omvandla embryonala musfibroblaster till inducerade neuronala celler. Således är transkriptionell aktivering och epigenetisk ombyggnad av endogena huvudtranskriptionsfaktorer tillräckliga för omvandling mellan celltyper. Den snabba och ihållande aktiveringen av endogena gener i deras nativa kromatinkontext med detta tillvägagångssätt kan underlätta omprogrammering med övergående metoder som undviker genomisk integration och tillhandahåller en ny strategi för att övervinna epigenetiska hinder för cellödespecifikation.

Fasfasad processmodelleringsregenerering

Ett annat sätt att omprogrammera är simulering av processer som sker under amfibiebenets regenerering. Hos urodele amfibier är ett tidigt steg i regenerering av lemmar skelettmuskelfibrer dedifferentiering till ett cellulat som sprider sig till lemvävnad. Emellertid sekventiell liten molekyl behandling av muskelfiber med myoseverin, reversine (den aurora B-kinas -hämmare), och några andra kemikalier (BIO (glykogensyntaskinas-3-kinas-hämmare), lysofosfatidsyra (pleiotrop aktivator av G-proteinkopplade receptorer) , SB203580 ( p38 MAP -kinashämmare ) eller SQ22536 (adenylylcyklashämmare)) orsakar bildandet av nya muskelcelltyper liksom andra celltyper, såsom föregångare till fett-, ben- och nervsystemceller.

Antikroppsbaserad transdifferentiering

Forskarna upptäckte att GCSF -efterliknande antikropp kan aktivera en tillväxtstimulerande receptor på märgceller på ett sätt som inducerar märgstamceller som normalt utvecklas till vita blodkroppar för att bli neurala stamceller. Tekniken gör det möjligt för forskare att söka i stora bibliotek med antikroppar och snabbt välja dem med önskad biologisk effekt.

Omprogrammering av bakterier

Människans mag -tarmkanal koloniseras av ett stort samhälle av symbionter och kommensaler. Forskarna demonstrerar fenomenet somatisk cellprogrammering av bakterier och generering av multipotentialceller från vuxna humana dermala fibroblastceller genom att införliva mjölksyrabakterier. Denna cellulära transdifferentiering orsakas av ribosomer och "kan uppstå via donatorbakterier som sväljs och smälts av värdceller, som kan framkalla ribosomal stress och stimulera cellulär utvecklingsplasticitet ".

Villkorligt omprogrammerade celler

Schlegel och Liu visade att kombinationen av matarceller och en Rho-kinashämmare (Y-27632) inducerar normala och tumörepitelceller från många vävnader att föröka sig på obestämd tid in vitro. Denna process sker utan behov av transduktion av exogena virala eller cellulära gener. Dessa celler har benämnts "villkorligt omprogrammerade celler (CRC)". Induktionen av CRC är snabb och beror på omprogrammering av hela cellpopulationen. CRC uttrycker inte höga proteinnivåer som är karakteristiska för iPSC eller embryonala stamceller (ESC) (t.ex. Sox2, Oct4, Nanog eller Klf4). Denna induktion av CRC är reversibel och borttagning av Y-27632 och matare gör att cellerna kan differentieras normalt. CRC -teknik kan generera 2 × 10 ⁶ celler på 5 till 6 dagar från nålbiopsier och kan generera kulturer från kryokonserverad vävnad och från färre än fyra livskraftiga celler. CRC behåller en normal karyotyp och förblir nontumorigen. Denna teknik etablerar också effektivt cellkulturer från tumörer från människor och gnagare.

Möjligheten att snabbt generera många tumörceller från små biopsiprover och frusen vävnad ger betydande möjligheter för cellbaserad diagnostik och terapi (inklusive kemokänslighetstestning) och expanderar kraftigt värdet av biobank. Med hjälp av CRC -teknik kunde forskare identifiera en effektiv behandling för en patient med en sällsynt typ av lungtumör. Engleman's group beskriver en farmakogenomisk plattform som underlättar snabb upptäckt av läkemedelskombinationer som kan övervinna resistens med CRC -system. Dessutom tillåter CRC -metoden genetisk manipulation av epitelceller ex vivo och deras efterföljande utvärdering in vivo i samma värd. Medan inledande studier visade att samodling av epitelceller med schweiziska 3T3-celler J2 var avgörande för CRC-induktion, med transwellkulturplattor, krävs inte fysisk kontakt mellan matare och epitelceller för att inducera CRC, och ännu viktigare, bestrålning av matarkellerna krävs för denna induktion. I överensstämmelse med transwell -experimenten inducerar och underhåller konditionerat medium CRC, vilket åtföljs av en samtidig ökning av cellulär telomerasaktivitet. Aktiviteten hos det konditionerade mediet korrelerar direkt med strålningsinducerad matningscellapoptos. Således medieras villkorlig omprogrammering av epitelceller av en kombination av Y-27632 och en eller flera lösliga faktorer som frigörs av apoptotiska matningsceller.

Riegel et al. visa att mus-ME-celler, isolerade från normala bröstkörtlar eller från mus-brösttumörvirus (MMTV) -Neu-inducerade brösttumörer, kan odlas på obestämd tid som villkorligt omprogrammerade celler (CRC). Cellyta stamfader-associerade markörer induceras snabbt i normala mus-ME-CRC i förhållande till ME-celler. Uttrycket av vissa underpopulationer hos bröstcancer, såsom CD49f+ ESA+ CD44+, sjunker dock avsevärt i senare passager. Icke desto mindre gav mus-ME-CRC: er som odlats i en tredimensionell extracellulär matris upphov till mammära acinarstrukturer. ME-CRC isolerade från MMTV-Neu transgena musbrösttumörer uttrycker höga nivåer av HER2/neu, liksom tumörinitierande cellmarkörer, såsom CD44+, CD49f+och ESA+(EpCam). Dessa uttrycksmönster upprätthålls i senare CRC -passager. Tidig och sen passage ME-CRC från MMTV-Neu-tumörer som implanterades i bröstfettkuddarna hos syngeniska eller nakna möss utvecklade vaskulära tumörer som metastaserades inom 6 veckor efter transplantationen. Viktigare var att histopatologin för dessa tumörer inte kunde skiljas från föräldrastumörerna som utvecklas i MMTV-Neu-mössen. Tillämpning av CRC -systemet på musbröstepitelceller ger ett attraktivt modellsystem för att studera genetik och fenotyp av normalt och transformerat musepitel i en definierad odlingsmiljö och i in vivo transplantationsstudier.

Ett annat tillvägagångssätt för CRC är att hämma CD47- ett membranprotein som är trombospondin-1- receptorn. Förlust av CD47 möjliggör ihållande spridning av primära murina endotelceller, ökar asymmetrisk uppdelning och gör det möjligt för dessa celler att spontant omprogrammera för att bilda multipotenta embryoida kroppsliknande kluster. CD47 knockdown ökar akut mRNA- nivåerna av c-Myc och andra stamcellstranskriptionsfaktorer i celler in vitro och in vivo. Trombospondin-1 är en viktig miljösignal som hämmar självförnyelse av stamceller via CD47. Således möjliggör CD47-antagonister cellförnyelse och omprogrammering genom att övervinna negativ reglering av c-Myc och andra stamcellstranskriptionsfaktorer. In vivo-blockad av CD47 med hjälp av en antisense- morfolino ökar överlevnaden för möss som utsätts för dödlig total kroppsbestrålning på grund av ökad proliferativ kapacitet hos benmärgs-härledda celler och radioskydd av radiokänsliga gastrointestinala vävnader.

Släktspecifika förstärkare

Differentierade makrofager kan förnya sig själv i vävnader och expandera långsiktigt i kulturen. Under vissa förhållanden kan makrofager dela sig utan att förlora funktioner de har förvärvat medan de specialiserat sig på immunceller - vilket vanligtvis inte är möjligt med differentierade celler . Makrofagerna uppnår detta genom att aktivera ett gennätverk som liknar det som finns i embryonala stamceller. Single-cellanalys avslöjade att, in vivo , kan prolifererande makrofager åter undertrycka en makrofag-specifik enhancer repertoaren associerad med en gen nätverk som styr självförnyelse. Detta hände när koncentrationerna av två transkriptionsfaktorer som heter MafB och c-Maf var naturligt låga eller inhiberades under en kort tid. Genetiska manipulationer som stängde av MafB och c-Maf i makrofagerna fick cellerna att starta ett självförnyelseprogram. Det liknande nätverket styr också självförnyelse av embryonala stamceller men är associerat med distinkta embryonala stamcellsspecifika förstärkare.

Därför delar makrofager isolerade från MafB- och c-Maf-dubbla bristfälliga möss på obestämd tid; självförnyelsen beror på c-Myc och Klf4 .

Indirekt härstamningskonvertering

Indirekt härstamningskonvertering är en omprogrammeringsmetodik där somatiska celler övergår genom ett plastmellanläge av delvis omprogrammerade celler (pre-iPSC), inducerad av kort exponering för omprogrammeringsfaktorer, följt av differentiering i en speciellt utvecklad kemisk miljö (artificiell nisch).

Denna metod kan vara både effektivare och säkrare, eftersom den inte verkar ge tumörer eller andra oönskade genetiska förändringar och resulterar i mycket större avkastning än andra metoder. Säkerheten för dessa celler förblir emellertid tveksam. Eftersom härstamningskonvertering från pre-iPSC förlitar sig på användningen av iPSC-omprogrammeringsförhållanden kan en bråkdel av cellerna förvärva pluripotenta egenskaper om de inte stoppar de-differentieringsprocessen in vitro eller på grund av ytterligare av-differentiering in vivo.

Yttre membran glykoprotein

Gemensamt för pluripotenta stamceller är den specifika naturen hos protein glykosylering av deras yttre membran. Det skiljer dem från de flesta icke -pluripotenta celler, men inte från vita blodkroppar . De glykaner på stamcellsytan svarar snabbt till förändringar i cellulär tillstånd och signalering och är därför idealiska för att identifiera även mindre förändringar i cellpopulationer. Många stamcellsmarkörer är baserade på glykanepitoper på cellytan, inklusive de mycket använda markörerna SSEA-3 , SSEA-4, Tra 1-60 och Tra 1-81. Suila Heli et al. spekulera i att extracellulära O-GlcNAc och extracellulära O-LacNAc i mänskliga stamceller spelar en avgörande roll för finjusteringen av Notch-signalvägen- ett mycket konserverat cellsignalsystem som reglerar cellödespecifikation, differentiering, vänster-höger asymmetri, apoptos, somitogenes och angiogenes, och spelar en nyckelroll i stamcellsproliferation (granskad av Perdigoto och Bardin och Jafar-Nejad et al.)

Förändringar i yttre membranprotein glykosylering är markörer för celltillstånd som på något sätt är kopplade till pluripotens och differentiering. Glykosyleringsförändringen är tydligen inte bara resultatet av initialiseringen av genuttryck, utan fungerar också som en viktig genregulator som är involverad i förvärv och underhåll av det odifferentierade tillståndet.

Till exempel inducerar aktivering av glykoprotein ACA, som länkar glykosylfosfatidylinositol på ytan av stamcellerna i humant perifert blod, ökat uttryck av gener Wnt , Notch-1 , BMI1 och HOXB4 genom en signalkaskad PI3K / Akt / mTor / PTEN och främjar bildandet av en självförnyande population av hematopoetiska stamceller.

Vidare leder dedifferentiering av stamceller inducerade av ACA-beroende signalväg till ACA-inducerade pluripotenta stamceller, som kan differentiera in vitro till celler i alla tre könsskikt . Studien av lektins förmåga att upprätthålla en kultur av pluripotenta mänskliga stamceller har lett till upptäckten av lektin Erythrina crista-galli (ECA), som kan fungera som en enkel och mycket effektiv matris för odling av mänskliga pluripotenta stamceller.

Omprogrammering med ett proteoglykan

En alternativ strategi för att konvertera somatiska celler till pluripotenta stater kan vara kontinuerlig stimulering av fibroblaster med en enda ECM proteoglykan , fibromodulin . Sådana celler uppvisar förmåga för skelettmuskelregenerering med markant lägre tumörrisk jämfört med iPSC. Den minskade tumorigeniciteten hos sådana celler är relaterad till CDKN2B -uppreglering under den rekombinanta humana fibromodulin -omprogrammeringsprocessen

Omprogrammering genom ett fysiskt tillvägagångssätt

Celladhesionsprotein E-cadherin är oumbärligt för en robust pluripotent fenotyp . Under omprogrammering för iPS -cellgenerering kan N-cadherin ersätta E-cadherins funktion. Dessa funktioner för kadheriner är inte direkt relaterade till vidhäftning, eftersom sfärmorfologi hjälper till att upprätthålla stamcellernas "stabilitet". Dessutom orsakar sfärbildning, på grund av påtvingad celltillväxt på en låg fästyta, ibland omprogrammering. Till exempel kan neurala stamceller genereras från fibroblaster direkt genom ett fysiskt tillvägagångssätt utan att införa exogena omprogrammeringsfaktorer.

Fysiska signaler, i form av parallella mikrospår på ytan av cellhäftande substrat, kan ersätta effekterna av småmolekylära epigenetiska modifierare och avsevärt förbättra omprogrammeringseffektiviteten. Mekanismen bygger på mekanomodulering av cellernas epigenetiska tillstånd. Specifikt leder "minskad histondeacetylasaktivitet och uppreglering av uttrycket av WD -upprepad domän 5 (WDR5) - en subenhet av H3 -metyltranferas - av mikrospårade ytor till ökad histon -H3 -acetylering och metylering". Nanofibrösa ställningar med inriktad fiberorientering ger effekter som liknar dem som produceras av mikrospår, vilket tyder på att förändringar i cellmorfologi kan vara ansvariga för modulering av det epigenetiska tillståndet.

Roll av celladhesioner i neural utveckling . Bild med tillstånd av Wikipedia -användare JWSchmidt under GNU Free Documentation License

Substratstyvhet är en viktig biofysisk signal som påverkar neural induktion och subtypspecifikation. Till exempel främjar mjuka substrat neuroepitelial omvandling samtidigt som de hämmar neural crest -differentiering av hESC på ett BMP4 -beroende sätt. Mekanistiska studier avslöjade en målinriktad mekanotransduktiv process som involverar mekanosensitiv Smad- fosforylering och nukleocytoplasmatisk shuttling, reglerad av styvhetsberoende Hippo / YAP- aktiviteter och aktomyosin cytoskeletets integritet och kontraktilitet .

Musens embryonala stamceller (mESC) genomgår självförnyelse i närvaro av cytokinleukemihämmande faktor (LIF). Efter tillbakadragande av LIF differentieras mESC, åtföljt av en ökning av cell -substrat vidhäftning och cellspridning. Begränsad cellspridning i frånvaro av LIF genom att antingen odla mESC på kemiskt definierade, svagt vidhäftande biosubstrat eller genom att manipulera cytoskelet , tillät cellerna att förbli i ett odifferentierat och pluripotent tillstånd. Effekten av begränsad cellspridning på mESC-självförnyelse medieras inte av ökad intercellulär vidhäftning, eftersom hämning av mESC-vidhäftning med hjälp av en funktion som blockerar anti-E-cadherin-antikropp eller siRNA inte främjar differentiering. Möjliga mekanismer för stamcells öde förutbestämning genom fysiska interaktioner med den extracellulära matrisen har beskrivits.

En ny metod har utvecklats som förvandlar celler till stamceller snabbare och mer effektivt genom att 'klämma' dem med hjälp av 3D -mikromiljöstyvhet och densitet hos den omgivande gelén. Tekniken kan tillämpas på ett stort antal celler för att producera stamceller för medicinska ändamål i industriell skala.

Celler som är involverade i omprogrammeringsprocessen förändras morfologiskt när processen fortskrider. Detta resulterar i fysiska skillnader i vidhäftningskrafter mellan celler. Betydande skillnader i "limsignatur" mellan pluripotenta stamceller, delvis omprogrammerade celler, differentierade avkommor och somatiska celler möjliggjorde utvecklingen av separationsprocessen för isolering av pluripotenta stamceller i mikrofluidiska enheter , vilket är:

1. snabb (separation tar mindre än 10 minuter);
2. effektiv (separation resulterar i mer än 95 procent ren iPS -cellodling);
3. oskadlig (cellöverlevnad är högre än 80 procent och de resulterande cellerna behåller normala transkriptionella profiler, differentieringspotential och karyotyp).

Stamceller har mekaniskt minne (de kommer ihåg tidigare fysiska signaler) -med Hippos signalvägsfaktorer : Ja-associerat protein (YAP) och transkriptionell koaktivator med PDZ-bindande domän (TAZ) som fungerar som en intracellulär mekanisk reostat-som lagrar information från tidigare fysiska miljöer och påverkar cellernas öde.

Neurala stamceller

Stroke och många neurodegenerativa sjukdomar, såsom Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom och amyotrofisk lateral skleros, behöver cellersättningsterapier. Den framgångsrika användningen av konverterade neurala celler (cN) vid transplantationer öppnar en ny väg för att behandla sådana sjukdomar. Ändå är inducerade neuroner (iN) direkt omvandlade från fibroblaster terminalt engagerade och uppvisar mycket begränsad proliferativ förmåga som kanske inte ger tillräckligt med autologa donatorceller för transplantation. Självförnyande inducerade neurala stamceller (iNSC) ger ytterligare fördelar jämfört med iN för både grundforskning och kliniska tillämpningar.

Till exempel, under specifika tillväxtförhållanden, kan musfibroblaster omprogrammeras med en enda faktor, Sox2, för att bilda iNSC som förnyas själv i kultur och efter transplantation och kan överleva och integreras utan att bilda tumörer i mushjärnor. INSCs kan härledas från vuxna humana fibroblaster med icke-virala tekniker, vilket ger en säker metod för autolog transplantation eller för utveckling av cellbaserade sjukdomsmodeller.

Neurala kemiskt inducerade stamceller (ciNPC) kan genereras från musstjärtfibroblaster och somatiska urinceller från människor utan att införa exogena faktorer, men - genom en kemisk cocktail, nämligen VCR (V, VPA , en hämmare av HDAC ; C, CHIR99021, en hämmare av GSK-3-kinaser och R, RepSox , en hämmare av TGF-beta-signalvägar ), under ett fysiologiskt hypoxiskt tillstånd . Alternativa cocktails med hämmare av histondeacetylering, glykogensyntaskinas och TGF-β-vägar (där: natriumbutyrat (NaB) eller Trichostatin A (TSA) kan ersätta VPA, litiumklorid (LiCl) eller litiumkarbonat (Li2CO3) kan ersätta CHIR99021 eller Repsox kan ersättas med SB-431542 eller Tranilast ) visar liknande effektivitet för ciNPC-induktion. Zhang, et al., Rapporterar också mycket effektiv omprogrammering av musfibroblaster till inducerade neurala stamcellliknande celler (ciNSLC) med en cocktail bestående av nio komponenter.

Flera metoder för direkt transformation av somatiska celler till inducerade neurala stamceller har beskrivits.

Bevis på principiella experiment visar att det är möjligt att omvandla transplanterade humana fibroblaster och mänskliga astrocyter direkt i hjärnan som är konstruerade för att uttrycka inducerbara former av neurala omprogrammeringsgener till neuroner när omprogrammeringsgener ( Ascl1 , Brn2a och Myt1l ) aktiveras efter transplantation använder ett läkemedel.

Astrocyter - de vanligaste neurogliala hjärncellerna, som bidrar till ärrbildning som svar på skada - kan omprogrammeras direkt in vivo för att bli funktionella neuroner som bildar nätverk i möss utan behov av celltransplantation. Forskarna följde mössen i nästan ett år för att leta efter tecken på tumörbildning och rapporterade att de inte hittade några. Samma forskare har förvandlat ärrbildande astrocyter till stamceller, kallade neuroblaster, som återskapas till neuroner i den skadade vuxna ryggmärgen.

Oligodendrocytprekursorceller

Utan myelin för att isolera neuroner tappar nervsignaler snabbt kraft. Sjukdomar som angriper myelin, såsom multipel skleros, resulterar i nervsignaler som inte kan föröka sig till nervändar och som en följd av detta leder till kognitiva, motoriska och sensoriska problem. Transplantation av oligodendrocytprekursorceller (OPC), som framgångsrikt kan skapa myelinhöljen runt nervceller, är ett lovande potentiellt terapeutiskt svar. Direkt härstamningskonvertering av mus- och råttfibroblaster till oligodendrogliala celler ger en potentiell källa till OPC. Omvandling genom tvångsuttryck av både åtta eller av de tre transkriptionsfaktorerna Sox10, Olig2 och Zfp536 kan tillhandahålla sådana celler.

Kardiomyocyter

Cellbaserade in vivo-terapier kan ge ett transformativt tillvägagångssätt för att öka kärl- och muskeltillväxt och förhindra icke-kontraktil ärrbildning genom att leverera transkriptionsfaktorer eller mikroRNA till hjärtat. Hjärtfibroblaster, som representerar 50% av cellerna i däggdjurshjärtat, kan omprogrammeras till kardiomyocytliknande celler in vivo genom lokal leverans av hjärtkärntranskriptionsfaktorer (GATA4, MEF2C, TBX5 och för förbättrad omprogrammering plus ESRRG, MESP1, Myocardin och ZFPM2) efter koronar ligering . Dessa resultat implicerade terapier som direkt kan återmuskulera hjärtat utan celltransplantation. Effektiviteten av sådan omprogrammering visade sig dock vara mycket låg och fenotypen för mottagna kardiomyocytliknande celler liknar inte den hos en mogen normal kardiomyocyt. Vidare resulterade transplantation av hjärttranskriptionsfaktorer i skadade murina hjärtan i dålig cellöverlevnad och minimalt uttryck av hjärtgener.

Under tiden inträffade framsteg i metoderna för att erhålla hjärtmyocyter in vitro. Effektiv hjärtdifferentiering av humana iPS -celler gav upphov till stamfäder som kvarhölls i infarktade råtthjärtor och minskad ombyggnad av hjärtat efter ischemisk skada.

Forskargruppen, ledd av Sheng Ding, använde en cocktail av nio kemikalier (9C) för transdifferentiering av mänskliga hudceller till hjärtslagande celler. Med denna metod började mer än 97% av cellerna slå, en egenskap hos fullt utvecklade, friska hjärtceller. De kemiskt inducerade kardiomyocytliknande cellerna (ciCM) sammandragit och liknade mänskliga kardiomyocyter i sina transkriptom-, epigenetiska och elektrofysiologiska egenskaper. När de transplanterades i infekterade mushjärtan konverterades 9C-behandlade fibroblaster effektivt till ciCM och utvecklades till friska hjärtmuskelceller i organet. Denna kemiska omprogrammeringsmetod, efter ytterligare optimering, kan erbjuda ett enkelt sätt att ge de ledtrådar som får hjärtmuskeln att regenerera lokalt.

I en annan studie riktades ischemisk kardiomyopati i modellen för murininfarkt av iPS -celltransplantation. Det synkroniserade misslyckade ventriklar och erbjuder en regenererande strategi för att uppnå resynkronisering och skydd mot dekompensation genom förbättrad vänster ventrikelledning och kontraktilitet, minskad ärrbildning och omvänd strukturell ombyggnad. Ett protokoll genererade populationer på upp till 98% kardiomyocyter från hPSC: er helt enkelt genom att modulera den kanoniska Wnt -signalvägen vid definierade tidpunkter under differentiering med hjälp av lättillgängliga små molekylföreningar.

Upptäckten av mekanismerna som styr bildandet av kardiomyocyter ledde till utvecklingen av läkemedlet ITD-1, som effektivt rensar cellytan från TGF-β- receptor typ II och selektivt hämmar intracellulär TGF-β-signalering. Det förbättrar således selektivt differentieringen av otillåtna mesoderm till kardiomyocyter, men inte till vaskulära glatta muskler och endotelceller.

Ett projekt utsäde decellularized mus hjärtan med mänskliga iPSC-härledda multipotential kardiovaskulära stamceller. De införda cellerna migrerade, förökades och differentierades in situ till kardiomyocyter, glatta muskelceller och endotelceller för att rekonstruera hjärtan. Dessutom signalerade hjärtats extracellulära matris (substratet för hjärtställningen) de mänskliga cellerna till att bli de specialiserade celler som behövs för korrekt hjärtfunktion. Efter 20 dagars perfusion med tillväxtfaktorer började de konstruerade hjärtvävnaderna slå igen och reagerade på läkemedel.

Omprogrammering av hjärtfibroblaster till inducerade kardiomyocytliknande celler (iCM) in situ representerar en lovande strategi för hjärtregenerering. Möss exponerade in vivo för tre hjärttranskriptionsfaktorer GMT (Gata4, Mef2c, Tbx5) och småmolekylerna: SB-431542 (den transformerande tillväxtfaktorn (TGF) -β-hämmaren) och XAV939 (WNT-hämmaren) i 2 veckor efter hjärtinfarkt visade signifikant förbättrad omprogrammering (omprogrammeringseffektivitet ökade åtta gånger) och hjärtfunktion jämfört med dem som endast utsattes för GMT.

Se även: recension

Föryngring av muskelstamcellen

De äldre lider ofta av progressiv muskelsvaghet och regenerativ misslyckande, delvis på grund av förhöjd aktivitet hos p38α- och p38β-mitogenaktiverade kinasvägar i senescenta skelettmuskelstamceller. Att utsätta sådana stamceller för övergående inhibering av p38a och p38p i samband med odling på mjuka hydrogel -substrat expanderar snabbt och föryngrar dem som resulterar i återgång av deras styrka.

Hos geriatriska möss förlorar vilande satellitceller reversibel viloläge genom att byta till ett irreversibelt tillstånd före föråldring, orsakat av derepression av p16 INK4a (även kallat Cdkn2a). Vid skada misslyckas dessa celler med att aktiveras och expandera, även i en ungdomlig miljö. p16INK4a tystnad i geriatriska satellitceller återställer stillhet och muskelregenerativa funktioner.

Myogena förfäder för potentiell användning vid sjukdomsmodellering eller cellbaserade terapier riktade mot skelettmuskel kan också genereras direkt från inducerade pluripotenta stamceller med fritt flytande sfärisk kultur (EZ-sfärer) i ett odlingsmedium kompletterat med höga koncentrationer (100 ng/ml) av fibroblast-tillväxtfaktor-2 ( FGF-2 ) och epidermal tillväxtfaktor .

Hepatocyter

Till skillnad från nuvarande protokoll för att härleda hepatocyter från humana fibroblaster, genererade Saiyong Zhu et al., (2014) inte iPSCs, men med hjälp av små molekyler, korta omprogrammering till pluripotens för att generera ett inducerat multipotent stamcell (iMPC) från vilket endoderm stamceller och därefter differentierades hepatocyter (iMPC-Heps) effektivt. Efter transplantation till en immunsvag musmodell av humant leversvikt prolifererade iMPC-Heps i stor utsträckning och förvärvade nivåer av hepatocytfunktion liknande dem hos humana primära vuxna hepatocyter. iMPC-Heps bildade inte tumörer, troligen för att de aldrig gick in i ett pluripotent tillstånd.

En tarmkrypter - en tillgänglig och riklig källa till tarmepitelceller för omvandling till β -liknande celler.

Dessa resultat fastställer genomförbarheten av betydande leverbefolkning av möss med mänskliga hepatocyter genererade in vitro, vilket tar bort en långvarig vägspärr på vägen till autolog levercellterapi.

En cocktail av små molekyler, Y-27632 , A-83-01 (en TGFβ kinas/activin receptor som kinas ( ALK5 ) hämmare) och CHIR99021 (potent hämmare av GSK-3 ), kan omvandla råtta och mus mogna hepatocyter in vitro in i proliferativa bipotenta celler - CLiP (kemiskt inducerade leverprogenitorer). CLiPs kan differentieras till både mogna hepatocyter och biliära epitelceller som kan bilda funktionella duktala strukturer. I långsiktig kultur förlorade CLiPs inte sin spridningskapacitet och leverdifferentieringsförmåga och kan återbefolka kroniskt skadad levervävnad.

Insulinproducerande celler

Komplikationer av diabetes mellitus, såsom kardiovaskulära sjukdomar , retinopati , neuropati , nefropati och perifera cirkulationssjukdomar beror på sockerdysregulering på grund av brist på insulin från pankreatiska betaceller och kan vara dödliga om de inte behandlas. Ett av de lovande tillvägagångssätten för att förstå och bota diabetes är att använda pluripotenta stamceller (PSC), inklusive embryonala stamceller (ESC) och inducerade PCS (iPSC). Tyvärr liknar humana PSC-härledda insulinuttryckande celler liknar humana fetala β-celler snarare än vuxna β-celler. I motsats till vuxna β-celler, fetala P-celler verkar funktionellt omogna, såsom indikeras av ökad basal glukos sekretion och brist på glukosstimulering och bekräftas av RNA-seq vars transkript .

En alternativ strategi är omvandling av fibroblaster till distinkta endodermala stamcellpopulationer och, med hjälp av cocktails av signalfaktorer, framgångsrik differentiering av dessa endodermala stamceller till funktionella beta-liknande celler både in vitro och in vivo.

Överuttryck av de tre transkriptionsfaktorerna , PDX1 (krävs för pankreas knoppväxt och betacellsmognad), NGN3 (krävs för endokrina prekursorcellbildning) och MAFA (för betacellsmognad) kombination (kallad PNM) kan leda till transformation av vissa celltyper till ett betacellliknande tillstånd. En tillgänglig och riklig källa till funktionella insulinproducerande celler är tarmarna . PMN-uttryck i humana intestinala " organoider " stimulerar omvandlingen av tarmepitelceller till β-liknande celler som möjligen är acceptabla för transplantation .

Nephron Progenitors

Vuxna proximala tubulusceller omprogrammerades direkt till nefronfader till den embryonala njuren , med användning av en pool av sex gener av instruktiva transkriptionsfaktorer (SIX1, SIX2, OSR1, Eyes absent homolog 1 (EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) och Snail homolog 2 (SNAI2)) som aktiverade gener som överensstämmer med en cap mesenkym /nefronfader typ i den vuxna proximala tubuli cellinjen. Genereringen av sådana celler kan leda till cellulära terapier för vuxen njursjukdom . Embryonala njurorganoider placerade i vuxna råttnjurar kan genomgå vidare utveckling och vaskulär utveckling.

Blodkärlsceller

När blodkärlen åldras blir de ofta onormala i struktur och funktion, vilket bidrar till många åldersrelaterade sjukdomar, inklusive hjärtinfarkt, ischemisk stroke och åderförkalkning av artärer som försörjer hjärtat, hjärnan och nedre extremiteterna. Så ett viktigt mål är att stimulera kärlväxt för säkerhetscirkulationen för att förhindra förvärring av dessa sjukdomar. Induced Vascular Progenitor Cells (iVPC) är användbara för cellbaserad terapi som är utformad för att stimulera tillväxt av koronar säkerhet. De genererades genom delvis omprogrammering av endotelceller. Det vaskulära engagemanget för iVPC är relaterat till det epigenetiska minnet hos endotelceller, vilket skapar dem som cellulära komponenter i växande blodkärl. Det är därför som de, när iVPC implanterades i myokard , inplockades i blodkärlen och ökade koronar kollateralt flöde bättre än iPSC, mesenkymala stamceller eller nativa endotelceller.

Ex vivo genetisk modifiering kan vara en effektiv strategi för att förbättra stamcellsfunktionen. Till exempel cellulär terapi med genetisk modifiering med Pim-1- kinas (en nedströms effektor av Akt , som positivt reglerar neovaskulogenes) av benmärgs- härledda celler eller mänskliga hjärtfaderceller, isolerade från misslyckat myokard resulterar i reparationshållbarhet, tillsammans med förbättring av funktionella parametrar för myokardiell hemodynamisk prestanda.

Stamceller som extraheras från fettvävnad efter fettsugning kan samlas in till att bli stamceller till glattmuskelceller (iPVSMC) som finns i artärer och vener.

2D-kultursystemet för humana iPS-celler i samband med trippelmarkörsval ( CD34 (ett ytglykofosfoprotein uttryckt på utvecklingsmässigt tidiga embryonala fibroblaster), NP1 (receptor-neuropilin 1) och KDR ( kinasinsatsdomäninnehållande receptor)) för isolering av vaskulogena prekursorceller från humant iPSC, genererade endotelceller som efter transplantation bildade stabila, funktionella musblodkärl in vivo, varande i 280 dagar.

För att behandla infarkt är det viktigt att förhindra bildandet av fibrotisk ärrvävnad. Detta kan uppnås in vivo genom övergående applicering av parakrinfaktorer som omdirigerar stamcellsbidrag från inhemska hjärtfamiljer från ärrvävnad till kardiovaskulär vävnad. Till exempel, i en mus hjärtinfarktmodell, resulterar en enda intramyokardiell injektion av mänsklig vaskulär endotel tillväxtfaktor A mRNA (VEGF-A modRNA), modifierad för att undkomma kroppens normala försvarssystem, långsiktig förbättring av hjärtfunktionen på grund av mobilisering och omdirigering av epikardiella stamceller mot kardiovaskulära celltyper.

Blodstamceller

röda blodceller

RBC -transfusion är nödvändig för många patienter. Men hittills är utbudet av RBC fortfarande labilt. Dessutom riskerar transfusion att smitta av smittsamma sjukdomar. Ett stort utbud av säkra RBC genererade in vitro skulle hjälpa till att lösa detta problem. Ex vivo erytroidcellgenerering kan tillhandahålla alternativa transfusionsprodukter för att möta nuvarande och framtida kliniska krav. Röda blodkroppar (RBC) som genereras in vitro från mobiliserade CD34 -positiva celler har normal överlevnad när de transfunderas till en autolog mottagare. RBC producerat in vitro innehöll uteslutande fetalt hemoglobin (HbF), vilket räddar funktionaliteten hos dessa RBC. In vivo observerades övergången mellan fostret och det vuxna hemoglobinet efter infusion av kärnbildade erytroidprekursorer härrörande från iPSC. Även om RBC inte har kärnor och därför inte kan bilda en tumör, har deras omedelbara erytroblaster -prekursorer kärnor. Den terminala mognaden av erytroblaster till funktionella RBC kräver en komplex ombyggnadsprocess som slutar med extrudering av kärnan och bildandet av en enucleated RBC. Cellprogrammering stör ofta enukleation. Transfusion av in vitro-genererade RBC eller erytroblaster skyddar inte tillräckligt mot tumörbildning.

Den aryl kolväte receptorn (AhR) -vägen (som har visat sig vara inblandade i främjandet av cancercellutveckling) spelar en viktig roll i normal blodcellutveckling. AhR-aktivering i mänskliga hematopoetiska stamceller (HP) driver en oöverträffad expansion av HP: er, megakaryocyt- och erytroid-härstamningsceller. Se också Kortfattad granskning: SH2B3- genen kodar för en negativ regulator av cytokinsignalering och naturligt förekommande funktionsförlustvarianter i denna gen ökar RBC-antalet in vivo. Riktat undertryckande av SH2B3 i primära humana hematopoetiska stam- och stamceller förbättrade mognad och totalt utbyte av in vitro-härledda RBC. Dessutom möjliggjorde inaktivering av SH2B3 av CRISPR / Cas9 genomredigering i mänskliga pluripotenta stamceller förbättrad erytroidcellexpansion med bevarad differentiering. (Se även översikt.)

Trombocyter extruderade från megakaryocyter

Trombocyter

Trombocyter hjälper till att förhindra blödning hos trombocytopeniska patienter och patienter med trombocytemi . Ett betydande problem för multitransfuserade patienter är refraktäritet mot trombocytransfusioner. Således skulle förmågan att generera trombocytprodukter ex vivo och trombocytprodukter som saknar HLA-antigener i serumfria medier ha kliniskt värde. En RNA-interferensbaserad mekanism använde en lentiviral vektor för att uttrycka kort-hårnål-RNAi riktade mot β2-mikroglobulin-transkript i CD34-positiva celler. Genererade trombocyter visade en 85% minskning av klass I HLA -antigener. Dessa trombocyter tycktes ha normal funktion in vitro

En kliniskt tillämpbar strategi för härledning av funktionella trombocyter från mänsklig iPSC innefattar etablering av stabila odödliga morakaryocytfadercellinjer (imMKCL) genom doxycyklinberoende överuttryck av BMI1 och BCL-XL . De resulterande imMKCL: erna kan expanderas i kultur under längre perioder (4-5 månader), även efter kryokonservering . Att stoppa överuttrycket (genom avlägsnande av doxycyklin från mediet) av c-MYC, BMI1 och BCL-XL i växande imMKCL ledde till produktion av CD42b + trombocyter med funktionalitet som är jämförbar med den hos inhemska trombocyter på basis av en rad analyser in vitro och in vivo. Thomas et al., Beskriver en framåtprogrammeringsstrategi som förlitar sig på det samtidiga exogena uttrycket av 3 transkriptionsfaktorer: GATA1 , FLI1 och TAL1 . De framåtprogrammerade megakaryocyterna förökar sig och differentierar sig i kultur i flera månader med megakaryocytrenhet över 90% och når upp till 2x10 ⁵ mogna megakaryocyter per ingångshPSC. Funktionella trombocyter genereras genom hela kulturen vilket möjliggör prospektiv insamling av flera transfusionsenheter från så få som en miljon startande hPSC. Se även översikt

Immunceller

En specialiserad typ av vita blodkroppar , kända som cytotoxiska T -lymfocyter (CTL), produceras av immunsystemet och kan känna igen specifika markörer på ytan av olika infektiösa eller tumörceller, vilket får dem att starta en attack för att döda de skadliga celler. Därefter har immunterapi med funktionella antigenspecifika T-celler potential som en terapeutisk strategi för att bekämpa många cancerformer och virusinfektioner. Men cellkällorna är begränsade eftersom de produceras i små mängder naturligt och har en kort livslängd.

Ett potentiellt effektivt tillvägagångssätt för att generera antigenspecifika CTL är att återföra mogna immuna T-celler till iPSC, som har obestämd spridningskapacitet in vitro och efter deras multiplikation för att locka dem att omdifferentiera tillbaka till T-celler.

En annan metod kombinerar iPSC och chimär antigenreceptor (CAR) teknik för att generera humana T -celler riktade mot CD19 , ett antigen uttryckt av maligna B -celler , i vävnadskultur. Detta tillvägagångssätt för att generera terapeutiska humana T -celler kan vara användbart för cancerimmunterapi och andra medicinska tillämpningar.

Varierande naturliga mördare T (iNKT) -celler har stor klinisk potential som hjälpmedel för immunterapi mot cancer. iNKT -celler fungerar som medfödda T -lymfocyter och fungerar som en bro mellan det medfödda och förvärvade immunsystemet . De förstärker antitumörsvar genom att producera interferon-gamma (IFN-γ). Metoden för insamling, omprogrammering/dedifferentiering, re-differentiering och injektion har föreslagits för relaterad tumörbehandling.

Dendritiska celler (DC) är specialiserade för att kontrollera T-cellsvar. DC med lämpliga genetiska modifieringar kan överleva tillräckligt länge för att stimulera antigenspecifik CTL och därefter elimineras helt. DC-liknande antigenpresenterande celler erhållna från humana inducerade pluripotenta stamceller kan tjäna som källa för vaccinationsterapi .

CCAAT/enhancer-bindande protein-α (C/EBPα) inducerar transdifferentiering av B-celler till makrofager vid hög effektivitet och förbättrar omprogrammering till iPS-celler när det uttrycks tillsammans med transkriptionsfaktorer Oct4, Sox2, Klf4 och Myc. med en 100-faldig ökning av iPS-cellens omprogrammeringseffektivitet, som involverar 95% av befolkningen. Dessutom kan C/EBPa omvandla utvalda humana B-celllymfom- och leukemicellinjer till makrofagliknande celler med hög effektivitet, vilket försämrar cellernas tumörbildande förmåga.

Thymiska epitelceller föryngring

Den bräss är den första organ att försämras som människor ålder. Denna krympning är en av huvudorsakerna till att immunsystemet blir mindre effektivt med åldern. Minskad expression av tymisk epitelceller transkriptionsfaktor FOXN1 har implicerats som en komponent av mekanismen regleråldersrelaterad involution.

Clare Blackburn och kollegor visar att etablerad åldersrelaterad tymisk involution kan vändas genom påtvingad uppreglering av bara en transkriptionsfaktor-FOXN1 i de tymiska epitelcellerna för att främja föryngring , spridning och differentiering av dessa celler till fullt fungerande tymiskt epitel. Denna föryngring och ökad spridning åtföljdes av uppreglering av gener som främjar cellcykelprogression ( cyklin D1 , ΔN p63 , FgfR2IIIb ) och som krävs i de tymiska epitelcellerna för att främja specifika aspekter av T -cellutveckling ( Dll4 , Kitl , Ccl25 , Cxcl12 , Cd40 , Cd80 , Ctsl , Pax1 ). I framtiden kan denna metod användas i stor utsträckning för att förbättra immunfunktionen och bekämpa inflammation i patienter genom att föryngra thymus in situ .

Mesenkymala stamceller

Induktion

Mesenkymala stam-/stromalceller (MSC) undersöks för applikationer inom hjärt-, njur-, neural-, led- och benreparation, samt vid inflammatoriska tillstånd och hemopoietisk cotransplantation. Detta beror på deras immunsuppressiva egenskaper och förmåga att differentieras till ett brett spektrum av mesenkymala släktvävnader. MSC skördas vanligtvis från vuxen benmärg eller fett, men dessa kräver smärtsamma invasiva ingrepp och är lågfrekventa källor, som endast utgör 0,001–0,01% av benmärgscellerna och 0,05% i fettsugningsaspirat. Av oro för autolog användning, i synnerhet hos äldre som är mest i behov av vävnadsreparation, minskar MSC i kvantitet och kvalitet med åldern.

IPSC kan erhållas genom cellernas föryngring av även hundraåringar. Eftersom iPSC kan skördas utan etiska begränsningar och kulturen kan utökas på obestämd tid, är de en fördelaktig källa till MSC. IPSC-behandling med SB-431542 leder till snabb och enhetlig MSC-generering från mänskliga iPSC. (SB-431542 är en hämmare av activin/TGF-vägar genom att blockera fosforylering av ALK4- , ALK5- och ALK7- receptorer.) Dessa iPS-MSC kan sakna teratombildande förmåga, uppvisa en normal stabil karyotyp i kultur och uppvisa tillväxt- och differentieringsegenskaper som liknar dem i primära MSC. Det har potential för in vitro-skalning, vilket möjliggör MSC-baserade terapier. MSC som härrör från iPSC har förmågan att underlätta periodontal regenerering och är en lovande källa till lättillgängliga stamceller för användning vid klinisk behandling av parodontit.

Lai et al., & Lu rapporterar den kemiska metoden för att generera MSC-liknande celler (iMSC) från humana primära dermala fibroblaster med sex kemiska hämmare (SP600125, SB202190, Go6983, Y-27632, PD0325901 och CHIR99021) med eller utan 3 tillväxtfaktorer (transformerande tillväxtfaktor-β (TGF-β), grundläggande fibroblast-tillväxtfaktor (bFGF) och leukemihämmande faktor (LIF)). Den kemiska cocktailen omvandlar direkt humana fibroblaster till iMSC med en monoskiktskultur på 6 dagar, och omvandlingsfrekvensen var cirka 38%.

Förutom cellterapi in vivo kan kulturen av humana mesenkymala stamceller användas in vitro för massproduktion av exosomer , som är idealiska vehiklar för läkemedelsleverans.

Dedifferentierade adipocyter

Fettvävnad , på grund av dess överflöd och relativt mindre invasiva skördmetoder, representerar en källa till mesenkymala stamceller (MSC). Tyvärr är fettsugningsaspirat endast 0,05% MSC. Emellertid, kan en stor mängd av mogna adipocyter, vilka i allmänhet har förlorat sina proliferativa förmåga och därför är typiskt förkastas, enkelt isoleras från adipös cellsuspensionen och avdifferentierade in lipid -fria fibroblastliknande celler, som heter dedifferentierade fett (DFAT) -celler . DFAT-celler återupprättar aktiv spridningsförmåga och uttrycker multipotent kapacitet. Jämfört med vuxna stamceller visar DFAT -celler unika fördelar i överflöd, isolering och homogenitet. Under korrekt induktionskultur in vitro eller korrekt miljö in vivo kan DFAT -celler demonstrera adipogena, osteogena, kondrogena och myogena potentialer. De kan också uppvisa perivaskulära egenskaper och framkalla neovaskularisering.

Kondrogena celler

Brosk är bindväven som ansvarar för friktionsfria rörelser i leden. Dess degeneration resulterar i slutändan i fullständig förlust av ledfunktion i de sena stadierna av artros . Som avaskulär och hypocellulär vävnad har brosk en begränsad kapacitet för självreparation. Kondrocyter är den enda celltypen i brosk, där de omges av den extracellulära matrisen som de utsöndrar och monterar.

En metod för att producera brosk är att inducera det från iPS -celler. Alternativt är det möjligt att omvandla fibroblaster direkt till inducerade kondrogena celler (iChon) utan ett mellanliggande iPS-cellstadium, genom att infoga tre omprogrammeringsfaktorer (c-MYC, KLF4 och SOX9). Mänskliga iChon -celler uttryckte markörgener för kondrocyter (typ II -kollagen) men inte fibroblaster.

Implanterade i defekter som skapats i ledbrusk hos råttor överlevde mänskliga iChon -celler för att bilda broskvävnad i minst fyra veckor, utan tumörer. Metoden använder sig av c-MYC, som antas ha en stor roll vid tumörgenes och använder ett retrovirus för att införa omprogrammeringsfaktorerna, exklusive det från omodifierad användning i humanterapi.

Källor till celler för omprogrammering

De vanligaste källorna för omprogrammering är blodceller och fibroblaster, erhållna genom hudbiopsi, men att ta celler från urinen är mindre invasivt. Den senare metoden kräver inte biopsi eller blodprov. Från och med 2013 hade urinledda stamceller differentierats till endoteliala, osteogena, kondrogena, adipogena, skelettmyogena och neurogena linjer utan att bilda teratom. Därför är deras epigenetiska minne lämpligt för omprogrammering till iPS -celler. Men få celler förekommer i urinen, endast låga omvandlingseffektiviteter hade uppnåtts och risken för bakteriell kontaminering är relativt hög.

En annan lovande källa till celler för omprogrammering är mesenkymala stamceller härrörande från mänskliga hårsäckar.

Ursprunget för somatiska celler som används för omprogrammering kan påverka omprogrammeringens effektivitet, de resulterande inducerade stamcellernas funktionella egenskaper och förmågan att bilda tumörer.

IPSC: er behåller ett epigenetiskt minne av ursprungets vävnad, vilket påverkar deras differentieringspotential. Detta epigenetiska minne manifesterar sig inte nödvändigtvis i pluripotensstadiet - iPSC som härrör från olika vävnader uppvisar korrekt morfologi, uttrycker pluripotensmarkörer och kan differentieras till de tre embryonala skikten in vitro och in vivo. Detta epigenetiska minne kan emellertid uppträda under omdifferentiering till specifika celltyper som kräver det specifika stället som bär kvarvarande epigenetiska märken.

Se även

Referenser

Vidare läsning