Grönt fluorescerande protein - Green fluorescent protein

"EGFP" omdirigerar här. För flygplatsen med den ICAO -flygplatskoden, se Pembrey Airport .
Grönt fluorescerande protein
PDB 1ema EBI.jpg
Struktur av Aequorea victoria grönt fluorescerande protein.
Identifierare
Symbol GFP
Pfam PF01353
Pfam -klan CL0069
InterPro IPR011584
CATH 1ema
SCOP2 1ema / SCOPe / SUPFAM
Grönt fluorescerande protein
Identifierare
Organism Aequorea victoria
Symbol GFP
UniProt P42212

Det gröna fluorescerande proteinet ( GFP ) är ett protein som uppvisar ljusgrön fluorescens när det utsätts för ljus i det blå till ultravioletta området. Etiketten GFP hänvisar traditionellt till proteinet som först isolerades från maneten Aequorea victoria och kallas ibland avGFP . GFP har dock hittats i andra organismer, inklusive koraller , havsanemoner , zoanithider , copepods och lansetter .

GFP från A. victoria har en stor excitationstopp vid en våglängd på 395 nm och en mindre vid 475 nm. Utsläppstoppen är vid 509 nm, vilket är i den nedre gröna delen av det synliga spektrumet . Fluorescenskvantutbyte (QY) av GFP är 0,79. GFP från havsblomman ( Renilla reniformis ) har en enda stor excitationstopp vid 498 nm. GFP är ett utmärkt verktyg i många former av biologi på grund av dess förmåga att bilda en inre kromofor utan att behöva några extra kofaktorer , genprodukter eller andra enzymer / substrat än molekylärt syre.

Inom cell- och molekylärbiologi används GFP -genen ofta som en uttrycksreporter . Det har använts i modifierade former för att göra biosensorer , och många djur har skapats som uttrycker GFP, vilket visar ett bevis på konceptet att en gen kan uttryckas genom en viss organism, i utvalda organ eller i celler av intresse. GFP kan introduceras i djur eller andra arter genom transgena tekniker , och bibehållas i deras genom och deras avkommas. Hittills har GFP uttryckts i många arter, inklusive bakterier, jäst, svamp, fisk och däggdjur, inklusive i mänskliga celler. Forskarna Roger Y. Tsien , Osamu Shimomura och Martin Chalfie tilldelades Nobelpriset i kemi 2008 den 10 oktober 2008 för sin upptäckt och utveckling av det gröna fluorescerande proteinet.

De flesta kommersiellt tillgängliga generna för GFP och liknande fluorescerande proteiner är cirka 730 baspar långa. Det naturliga proteinet har 238 aminosyror. Dess molekylmassa är 27 kD. Därför kan sammansmältning av GFP -genen till genen för ett protein av intresse öka proteinets storlek och molekylmassa avsevärt och kan försämra proteinets naturliga funktion eller ändra dess placering eller transportbana inom cellen.

Bakgrund

Aequorea victoria
3D-rekonstruktion av konfokalbild av VEGF-överuttryckande neurala stamfäder (röda) och GFP-positiva kontrollneurala stamfaderceller (gröna) i råttans luktlampa. RECA-1-positiva blodkärl-blå färg.

GFP (vildtyp) (wtGFP)

På 1960- och 1970 -talen renades GFP, tillsammans med det separata självlysande proteinet aequorin (ett enzym som katalyserar nedbrytningen av luciferin , som släpper ut ljus) först från maneterna Aequorea victoria och dess egenskaper som studerats av Osamu Shimomura . I A. victoria inträffar GFP -fluorescens när aequorin interagerar med Ca 2+ joner, vilket inducerar en blå glöd. En del av denna självlysande energi överförs till GFP och förskjuter den övergripande färgen mot grönt. Men dess användbarhet som ett verktyg för molekylära biologer började inte förverkligas förrän 1992 när Douglas Prasher rapporterade kloning och nukleotidsekvens av wtGFP i Gene . Finansieringen för detta projekt hade tagit slut, så Prasher skickade cDNA -prover till flera laboratorier. Labbet av Martin Chalfie uttryckte kodningssekvensen för wtGFP, med de första få aminosyrorna raderade, i heterologa celler av E. coli och C. elegans , publicerade resultaten i Science 1994. Frederick Tsujis laboratorium rapporterade oberoende uttryck av rekombinant protein en månad senare. Anmärkningsvärt nog vikde sig GFP -molekylen och var fluorescerande vid rumstemperatur, utan behov av exogena kofaktorer specifika för maneterna. Även om denna nära-wtGFP var fluorescerande hade den flera nackdelar, inklusive dubbla toppade excitationsspektra, pH-känslighet, kloridkänslighet, dåligt fluorescenskvantutbyte, dålig fotostabilitet och dålig vikning vid 37 ° C.

Den första rapporterade kristallstrukturen för en GFP var den för S65T-mutanten av Remington-gruppen i Science 1996. En månad senare rapporterade Phillips-gruppen oberoende om GFP-strukturen av vildtyp inom Nature Biotechnology . Dessa kristallstrukturer gav en viktig bakgrund om kromoforbildning och angränsande restinteraktioner. Forskare har modifierat dessa rester genom riktad och slumpmässig mutagenes för att producera det stora utbudet av GFP -derivat som används idag. Ytterligare forskning om GFP har visat att det är resistent mot tvättmedel, proteaser, guanidiniumklorid (GdmCl) behandlingar och drastiska temperaturförändringar.

GFP -derivat

Mångfalden av genetiska mutationer illustreras av denna San Diego -strandscen ritad med levande bakterier som uttrycker 8 olika färger av fluorescerande proteiner (härledda från GFP och dsRed).

På grund av potentialen för utbredd användning och forskarnas utvecklingsbehov har många olika mutanter av GFP konstruerats. Den första stora förbättringen var en enda punktmutation (S65T) som rapporterades 1995 i Nature av Roger Tsien . Denna mutation förbättrade dramatiskt GFP: s spektralegenskaper, vilket resulterade i ökad fluorescens, fotostabilitet och en förskjutning av den stora excitationstoppen till 488 nm, med toppemissionen kvar vid 509 nm. Detta matchade de spektrala egenskaperna hos vanligt tillgängliga FITC -filteruppsättningar , vilket ökade användbarheten för den allmänna forskaren. En 37 ° C vikningseffektivitet (F64L) punktmutant till denna ställning, vilket gav förbättrad GFP ( EGFP ), upptäcktes 1995 av laboratorierna i Thastrup och Falkow. EGFP tillät praktisk användning av GFP i däggdjursceller. EGFP har en extinktionskoefficient (betecknad ε) på 55 000 M −1 cm −1 . Fluorescenskvantutbyte (QY) av EGFP är 0,60. Den relativa ljusstyrkan, uttryckt som ε • QY, är 33 000 M −1 cm −1 .

Superfolder GFP ( sfGFP ), en serie mutationer som gör att GFP snabbt kan vika och mogna även när de smälts ihop till dåligt vikande peptider, rapporterades 2006.

Många andra mutationer har gjorts, inklusive färgmutanter; i synnerhet blått fluorescerande protein (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), cyanfluorescerande protein (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) och gula fluorescerande proteinderivat (YFP, Citrine, Venus, YPet). BFP -derivat (förutom mKalama1) innehåller Y66H -substitutionen. De uppvisar ett brett absorptionsband i det ultravioletta centrerat nära 380 nanometer och ett maxemission vid 448 nanometer. En grön fluorescerande proteinmutant ( BFPms1 ) som företrädesvis binder Zn (II) och Cu (II) har utvecklats. BFPms1 har flera viktiga mutationer inklusive och BFP-kromoforen (Y66H), Y145F för högre kvantutbyte, H148G för att skapa ett hål i beta-fatet och flera andra mutationer som ökar lösligheten. Zn (II) -bindning ökar fluorescensintensiteten, medan Cu (II) -bindning släcker fluorescens och förskjuter absorbansmaximumet från 379 till 444 nm. Därför kan de användas som Zn -biosensor.

En palett av varianter av GFP och DsRed.

Kromoforbindning . Den kritiska mutationen i cyanderivat är Y66W -substitutionen, som får kromoforen att bildas med en indol snarare än fenolkomponent. Flera ytterligare kompenserande mutationer i det omgivande fatet krävs för att återställa ljusstyrkan till denna modifierade kromofor på grund av den ökade massan av indolgruppen. I ECFP och Cerulean uppvisar den N-terminala hälften av den sjunde strängen två konformationer. Dessa konformationer har båda en komplex uppsättning van der Waals -interaktioner med kromoforen. Y145A- och H148D -mutationerna i Cerulean stabiliserar dessa interaktioner och gör det möjligt för kromoforen att vara mer plan, bättre packad och mindre benägen att släcka kollisioner.

Ytterligare platsriktad slumpmässig mutagenes i kombination med fluorescens livstidsbaserad screening har ytterligare stabiliserat den sjunde β-strängen vilket resulterat i en ljus variant, mTurquoise2, med ett kvantutbyte (QY) på 0,93. Den rödförskjutna våglängden för YFP-derivaten åstadkoms genom T203Y-mutationen och beror på π-elektronstaplingsinteraktioner mellan den substituerade tyrosinresten och kromoforen. Dessa två klasser av spektralvarianter används ofta för Förster resonance energy transfer ( FRET ) experiment. Genetiskt kodade FRET -reportrar som är känsliga för cellsignalmolekyler, såsom kalcium eller glutamat, proteinfosforyleringstillstånd, proteinkomplementering, receptordimerisering och andra processer ger mycket specifika optiska avläsningar av cellaktivitet i realtid.

Semirational mutagenes av ett antal rester ledde till pH-känsliga mutanter som kallas pHluoriner och senare superekliptiska pHluoriner. Genom att utnyttja den snabba förändringen i pH vid synaptisk vesikelfusion har pHluoriner taggade till synaptobrevin använts för att visualisera synaptisk aktivitet i neuroner.

Redoxkänslig GFP ( roGFP ) konstruerades genom införande av cystein i betafatstrukturen. Den redox tillstånd av cysteinerna bestämmer fluorescerande egenskaperna hos roGFP .

Nomenklatur

Nomenklaturen för modifierade GFP är ofta förvirrande på grund av överlappande kartläggning av flera GFP -versioner till ett enda namn. Till exempel hänvisar mGFP ofta till en GFP med en N-terminal palmitoylering som får GFP att binda till cellmembran . Men samma term används också för att hänvisa till monomerisk GFP, som ofta uppnås genom att dimergränssnittet bryter A206K -mutation. GFP av vildtyp har en svag dimeriseringstendens vid koncentrationer över 5 mg/ml. mGFP står också för "modifierad GFP", som har optimerats genom aminosyrautbyte för stabilt uttryck i växtceller.

I naturen

Levande lansett (B. floridae) under ett fluorescerande mikroskop.
Levande lansett ( B. floridae ) under ett fluorescerande mikroskop.
Grön fluorescens i marina copepod Pontella mimocerami.
Grön fluorescens i marina copepod Pontella mimocerami.

Syftet med både (primär) bioluminescens (från aequorins verkan på luciferin) och (sekundär) fluorescens av GFP i maneter är okänt. GFP uttrycks tillsammans med aequorin i små granulat runt manetklockans kant. Den sekundära excitationstoppen (480 nm) för GFP absorberar en del av den blå emissionen av aequorin, vilket ger bioluminescensen en mer grön nyans. Serin 65-återstoden av GFP- kromoforen är ansvarig för de dubbelspetsade excitationsspektra för vildtyps-GFP. Det bevaras i alla tre GFP -isoformer som ursprungligen klonades av Prasher. Nästan alla mutationer av denna rest konsoliderar excitationsspektra till en enda topp vid antingen 395 nm eller 480 nm. Den exakta mekanismen för denna känslighet är komplex, men det verkar innebära donering av ett väte från serin 65 till glutamat 222, vilket påverkar kromofore -jonisering. Eftersom en enda mutation dramatiskt kan öka 480 nm excitationstoppen, vilket gör GFP till en mycket effektivare partner för aequorin, verkar A. victoria evolutionärt föredra det mindre effektiva, dubbeltoppade excitationsspektrumet. Roger Tsien har spekulerat i att varierande hydrostatiskt tryck med djup kan påverka serin 65: s förmåga att donera ett väte till kromoforen och ändra förhållandet mellan de två excitationstopparna. Således kan maneterna förändra färgen på dess bioluminescens med djup. Men en kollaps i populationen av maneter i Friday Harbor , där GFP ursprungligen upptäcktes, har försvårat ytterligare studier av GFP: s roll i manetens naturliga miljö.

De flesta lanselarter är kända för att producera GFP i olika delar av kroppen. Till skillnad från A. victoria producerar lansetter inte sitt eget blåa ljus, och ursprunget för deras endogena GFP är fortfarande okänt. Vissa spekulerar i att det lockar plankton mot lanselettens mynning och fungerar som en passiv jaktmekanism. Det kan också fungera som ett fotoskyddande medel i larverna och förhindra skador orsakade av högintensivt blått ljus genom att omvandla det till grönt ljus med lägre intensitet. Dessa teorier har dock inte testats.

GFP-liknande proteiner har hittats i flera arter av marina copepoder , särskilt från familjerna Pontellidae och Aetideidae . GFP isolerat från Pontella mimocerami har visat hög ljusstyrka med ett kvantutbyte på 0,92, vilket gör dem nästan två gånger ljusare än den vanliga EGFP som isolerats från A. victoria.

Andra fluorescerande proteiner

Ett rack provrör som visar lösningar som lyser i olika färger
Olika proteiner producerar olika fluorescerande färger när de utsätts för ultraviolett ljus.

Det finns många GFP-liknande proteiner som, trots att de är i samma proteinfamilj som GFP, inte direkt härrör från Aequorea victoria . Dessa inkluderar dsRed , eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP/IrisFP, Dendra, och så vidare. Efter att ha utvecklats från proteiner i olika organismer, kan dessa proteiner ibland visa otippade tillvägagångssätt för kromoforbildning. Några av dessa, såsom KFP, är utvecklade från naturligt icke- eller svagt fluorescerande proteiner för att förbättras kraftigt genom mutagenes. När GFP-liknande fat med olika spektraegenskaper används kan excitationsspektra för en kromofor användas för att driva en annan kromofor (FRET), vilket möjliggör omvandling mellan ljusets våglängder.

FMN-bindande fluorescerande proteiner (FbFP) utvecklades 2007 och är en klass av små (11-16 kDa), syreoberoende fluorescerande proteiner som härrör från blåljusreceptorer. De är särskilt avsedda för användning under anaeroba eller hypoxiska förhållanden, eftersom bildandet och bindningen av Flavin -kromoforen inte kräver molekylärt syre, vilket är fallet med syntesen av GFP -kromoforen.

Vitt ljus bild, eller bild sett av ögat, av fluorescerande proteiner i bilden ovan.

Fluorescerande proteiner med andra kromoforer, såsom UnaG med bilirubin, kan visa unika egenskaper som rödförskjuten emission över 600 nm eller fotokonvertering från ett grönt emitterande tillstånd till ett rödemitterande tillstånd. De kan ha excitations- och emissionsvåglängder tillräckligt långt ifrån varandra för att uppnå konvertering mellan rött och grönt ljus.

En ny klass av fluorescerande protein utvecklades från ett cyanobakteriellt ( Trichodesmium erythraeum ) phycobiliprotein , α- allophycocyanin , och namngivet litet ultrarött fluorescerande protein ( smURFP ) 2016. smURFP inkorporerar autokatalytiskt själv kromoforen biliverdin utan behov av ett externt protein , känd som en lyas . Maneter - och korall härledd GFP-liknande proteiner kräver syre och producera en stökiometrisk mängd av väteperoxid vid kromofor bildning. smURFP kräver inte syre eller producerar väteperoxid och använder kromoforen , biliverdin . smURFP har en stor utrotningskoefficient (180 000 M −1 cm −1 ) och har ett blygsamt kvantutbyte (0,20), vilket gör den jämförbar biofysisk ljusstyrka med eGFP och ~ 2-faldigt ljusare än de flesta röda eller långt röda fluorescerande proteiner som härrör från korall . SmURFP -spektralegenskaper liknar det organiska färgämnet Cy5 .

E. coli -kolonier som uttrycker fluorescerande proteiner.

Recensioner av nya klasser av fluorescerande proteiner och applikationer finns i de citerade recensionerna.

Strukturera

Modell för spontan bildning av HBI -fluoroforen (markerad med grönt) i wtGFP.

GFP har en beta-fatstruktur som består av elva β-strängar med ett veckat arkarrangemang, med en alfa-helix som innehåller den kovalent bundna kromoforen 4- ( p- hydroxibensyliden) imidazolidin-5-on (HBI) som löper genom mitten. Fem kortare alfa -spiraler bildar lock på strukturens ändar. Den betatunna strukturen är en nästan perfekt cylinder, 42A lång och 24A i diameter (vissa studier har rapporterat en diameter på 30 Å), skapa vad som hänvisas till som en "β-can" formation, som är unik för den GFP-liknande familjen . HBI, den spontant modifierade formen av tripeptiden Ser65 – Tyr66 – Gly67, är icke-fluorescerande i frånvaro av den korrekt vikta GFP-ställningen och finns huvudsakligen i den ojoniserade fenolformen i wtGFP. Inåtvända sidkedjor i fatet inducerar specifika cykliseringsreaktioner i Ser65 – Tyr66 – Gly67 som inducerar jonisering av HBI till fenolatformen och kromoforbildning . Denna process för post-translationell modifiering kallas mognad . Vätebindningsnätverket och elektronstaplingsinteraktioner med dessa sidkedjor påverkar färgen, intensiteten och fotostabiliteten hos GFP och dess många derivat. Fatets tätt packade karaktär utesluter lösningsmedelsmolekyler som skyddar kromoforfluorescensen från att släcka med vatten. Förutom autocykliseringen av Ser65-Tyr66-Gly67 sker en 1,2-dehydrogeneringsreaktion vid Tyr66-resten. Förutom de tre resterna som bildar kromoforen fungerar rester som Gln94, Arg96, His148, Thr203 och Glu222 alla som stabilisatorer. Resterna av Gln94, Arg96 och His148 kan stabilisera genom att avlägsna kromoforladdningen. Arg96 är den viktigaste stabiliserande återstoden på grund av det faktum att den föranleder de nödvändiga strukturella justeringar som är nödvändiga från HBI -ringen att inträffa. Varje mutation till Arg96 -resten skulle resultera i en minskning av kromoforns utvecklingshastighet eftersom korrekta elektrostatiska och steriska interaktioner skulle gå förlorade. Tyr66 är mottagare av vätebindningar och joniserar inte för att producera gynnsam elektrostatik.

GFP -film som visar hela strukturen och zoomar in till fluorescerande kromofor.
GFP-molekyler ritade i tecknad stil, en helt och en med sidan av betatunnan skuren bort för att avslöja kromoforen (markerad som boll-och-stick ). Från PDB : 1GFL .
GFP -banddiagram. Från PDB : 1EMA .

Ansökningar

Reporteranalyser

Grönt fluorescerande protein kan användas som en reportergen .

Till exempel kan GFP användas som en reporter för miljögifter. Detta protein har visat sig vara ett effektivt sätt att mäta toxicitetsnivåerna för olika kemikalier inklusive etanol, p -formaldehyd, fenol, triklosan och paraben. GFP är utmärkt som ett reporterprotein eftersom det inte har någon effekt på värden när det introduceras i värdens cellulära miljö. På grund av denna förmåga behövs ingen extern visualiseringsfläck, ATP eller kofaktorer. När det gäller föroreningsnivåer mättes fluorescensen för att mäta effekten som föroreningarna har på värdcellen. Värdcellens celldensitet mättes också. Resultat från studien utförd av Song, Kim och Seo (2016) visade att det skedde en minskning av både fluorescens och celltäthet när föroreningsnivåerna ökade. Detta var ett tecken på det faktum att cellulär aktivitet hade minskat. Mer forskning om denna specifika applikation för att bestämma den mekanism genom vilken GFP fungerar som en förorenande markör. Liknande resultat har observerats i zebrafisk eftersom zebrafiskar som injicerades med GFP var ungefär tjugo gånger mer mottagliga för att känna igen cellulära påfrestningar än zebrafiskar som inte injicerades med GFP.

Fördelar

Den största fördelen med GFP är att det kan vara ärftligt, beroende på hur det introducerades, vilket möjliggör fortsatt studie av celler och vävnader som det uttrycks i. Visualisering av GFP är icke -invasiv, vilket endast kräver belysning med blått ljus. GFP ensam stör inte biologiska processer, men när det smälts till proteiner av intresse krävs noggrann design av länkar för att bibehålla funktionen hos proteinet av intresse. Dessutom, om den används med en monomer kan den lätt diffundera genom cellerna.

Fluorescensmikroskopi

Huvudartikel: Fluorescensmikroskop
Superupplösning med två fusionsproteiner (GFP-Snf2H och RFP-H2A), samlokaliseringsstudier (2CLM) i kärnan i en bencancercell. 120.000 lokaliserade molekyler i ett vidfältsområde (470 µm 2 ).

Tillgängligheten för GFP och dess derivat har grundligt omdefinierat fluorescensmikroskopi och hur det används inom cellbiologi och andra biologiska discipliner. Medan de flesta små fluorescerande molekyler som FITC (fluoresceinisotiocyanat) är starkt fototoxiska när de används i levande celler, är fluorescerande proteiner som GFP vanligtvis mycket mindre skadliga när de belyses i levande celler. Detta har utlöst utvecklingen av högautomatiserade levande cellfluorescensmikroskopisystem, som kan användas för att observera celler över tid som uttrycker ett eller flera proteiner märkta med fluorescerande proteiner.

Det finns många tekniker för att använda GFP i ett experiment med levande celler. Det mest direkta sättet att använda GFP är att direkt fästa den på ett protein av intresse. Till exempel kan GFP inkluderas i en plasmid som uttrycker andra gener för att indikera en framgångsrik transfektion av en gen av intresse. En annan metod är att använda en GFP som innehåller en mutation där fluorescensen kommer att förändras från grönt till gult med tiden, vilket kallas en fluorescerande timer. Med fluorescerande timer kan forskare studera tillståndet för proteinproduktion såsom nyligen aktiverat, kontinuerligt aktiverat eller nyligen inaktiverat baserat på färgen som rapporteras av det fluorescerande proteinet. I ytterligare ett exempel har forskare modifierat GFP för att bli aktiv först efter exponering för bestrålning, vilket ger forskare ett verktyg för att selektivt aktivera vissa delar av en cell och observera var proteiner märkta med GFP rör sig från startplatsen. Dessa är bara två exempel på ett växande område av fluorescerande mikroskopi och en mer fullständig genomgång av biosensorer som använder GFP och andra fluorescerande proteiner kan hittas här

Till exempel hade GFP använts i stor utsträckning vid märkning av spermier för olika organismer för identifieringsändamål som i Drosophila melanogaster , där uttryck av GFP kan användas som markör för en särskild egenskap. GFP kan också uttryckas i olika strukturer som möjliggör morfologisk distinktion. I sådana fall inkorporeras genen för produktion av GFP i organismens genom i regionen av DNA: t som kodar för målproteinerna och som styrs av samma regleringssekvens ; det vill säga att genens regleringssekvens nu styr produktionen av GFP, förutom det / de märkta proteinet / proteinerna. I celler där genen uttrycks och de märkta proteinerna produceras, produceras GFP samtidigt. Således kommer endast de celler i vilka den märkta genen uttrycks, eller målproteinerna produceras, att fluorescera när de observeras under fluorescensmikroskopi. Analys av sådana tidsförloppsfilmer har omdefinierat förståelsen för många biologiska processer, inklusive proteinflingning, proteintransport och RNA -dynamik, som tidigare hade studerats med hjälp av fast (dvs dödt) material. Erhållen data används också för att kalibrera matematiska modeller av intracellulära system och för att uppskatta genuttryckshastigheter. På samma sätt kan GFP användas som en indikator på proteinuttryck i heterologa system. I detta scenario introduceras fusionsproteiner som innehåller GFP indirekt med RNA från konstruktionen, eller direkt, med själva märkta proteinet. Denna metod är användbar för att studera strukturella och funktionella egenskaper hos det märkta proteinet på en makromolekylär eller enmolekylerad skala med fluorescensmikroskopi.

Den Vertico SMI mikroskop med användning av SPDM Phymod tekniken använder den så kallade "reversibel fotoblekning" effekten av fluorescerande färgämnen såsom GFP och dess derivat för att lokalisera dem som enstaka molekyler i en optisk upplösning på 10 nm. Detta kan också utföras som en samlokalisering av två GFP-derivat (2CLM).

En annan kraftfull användning av GFP är att uttrycka proteinet i små uppsättningar av specifika celler. Detta gör det möjligt för forskare att optiskt upptäcka specifika celltyper in vitro (i en maträtt), eller till och med in vivo (i den levande organismen). Genetiskt att kombinera flera spektralvarianter av GFP är ett användbart trick för analys av hjärnkretsar ( Brainbow ). Andra intressanta användningsområden för fluorescerande proteiner i litteraturen inkluderar användning FP som sensorer av neuronmembranpotential , spårning av AMPA -receptorer på cellmembran, viralt inträde och infektionen av individuella influensavirus virus och lentivirala virus, etc.

Det har också visat sig att nya linjer av transgena GFP -råttor kan vara relevanta för såväl genterapi som för regenerativ medicin. Genom att använda "höguttryckande" GFP uppvisar transgena råttor högt uttryck i de flesta vävnader och många celler som inte har karakteriserats eller endast har varit dåligt karakteriserade i tidigare GFP-transgena råttor.

GFP har visat sig vara användbart inom kryobiologi som en lönsamhetsanalys . Korrelation av livskraft mätt med trypanblå analyser var 0,97. En annan applikation är användningen av GFP-co-transfektion som intern kontroll för transfektionseffektivitet i däggdjursceller.

En ny möjlig användning av GFP inkluderar att använda den som en känslig övervakare av intracellulära processer via ett eGFP -lasersystem tillverkat av en mänsklig embryonisk njurcellinje. Den första konstruerade levande lasern är gjord av en eGFP -uttryckande cell inuti ett reflekterande optiskt hålrum och träffar den med pulser av blått ljus. Vid en viss pulströskel blir eGFP: s optiska utgång ljusare och helt enhetlig i färgen av rent grönt med en våglängd på 516 nm. Innan det avges som laserljus studsar ljuset fram och tillbaka i resonatorhålan och passerar cellen flera gånger. Genom att studera förändringarna i optisk aktivitet kan forskare bättre förstå cellulära processer.

GFP används i stor utsträckning inom cancerforskning för att märka och spåra cancerceller. GFP-märkta cancerceller har använts för att modellera metastaser, processen genom vilken cancerceller sprids till avlägsna organ.

Dela GFP

GFP kan användas för att analysera kolokaliseringen av proteiner. Detta uppnås genom att "dela" proteinet i två fragment som är i stånd att självmontera och sedan smälta var och en av dessa till de två intressanta proteinerna. Bara dessa ofullständiga GFP -fragment kan inte fluorescera. Men om de två proteinerna av intresse kolokaliseras, samlas de två GFP-fragmenten tillsammans för att bilda en GFP-liknande struktur som kan fluorescera. Därför är det möjligt att bestämma om de två proteinerna av intresse kolokaliseras genom att mäta fluorescensnivån.

Makrofotografering

Makroskaliga biologiska processer, såsom spridning av virusinfektioner, kan följas med GFP-märkning. Tidigare har mutagent ultraviolett ljus (UV) använts för att belysa levande organismer (t.ex. se) för att detektera och fotografera GFP -uttrycket. Nyligen har en teknik som använder icke-mutagena LED-lampor utvecklats för makrofotografering. Tekniken använder en epifluorescens -kamerafästning baserad på samma princip som används vid konstruktionen av epifluorescensmikroskop .

Transgena husdjur

Möss som uttrycker GFP under UV -ljus (vänster och höger), jämfört med normal mus (i mitten)

Alba , en grön-fluorescerande kanin, skapades av ett franskt laboratorium på uppdrag av Eduardo Kac med hjälp av GFP för konständamål och sociala kommentarer. Det amerikanska företaget Yorktown Technologies marknadsför till akvariebutiker gröna fluorescerande zebrafiskar ( GloFish ) som ursprungligen utvecklades för att upptäcka föroreningar i vattenvägar. NeonPets, ett amerikanskt företag har marknadsfört gröna fluorescerande möss till husdjursindustrin som NeonMice. Gröna fluorescerande grisar, kända som Noels, föddes upp av en grupp forskare som leddes av Wu Shinn-Chih vid Institutionen för djurvetenskap och teknik vid National Taiwan University . Ett japansk-amerikanskt team skapade gröna-fluorescerande katter som bevis på konceptet för att använda dem potentiellt som modellorganismer för sjukdomar, särskilt HIV . År 2009 uppfödde ett sydkoreanskt team från Seoul National University de första transgena beaglarna med fibroblastceller från havsanemoner. Hundarna avger ett rött fluorescerande ljus, och de är avsedda att låta forskare studera de gener som orsakar mänskliga sjukdomar som narkolepsi och blindhet.

Konst

Julian Voss-Andreae , en tyskfödd konstnär som specialiserat sig på "proteinskulpturer", skapade skulpturer baserade på GFP: s struktur, inklusive 1,70 m (5'6 ") höga" Green Fluorescent Protein "(2004) och 1,40 m ( 4'7 ") hög" Steel Maneter "(2006). Den senare skulptur ligger på den plats där GFP upptäckt av Shimomura 1962, den University of Washington 's Friday Harbor Laboratories .

Julian Voss-Andreaes GFP-baserade skulptur Steel Jellyfish (2006). Bilden visar skulpturen i rostfritt stål vid Friday Harbor Laboratories på San Juan Island (Wash., USA), platsen för GFP: s upptäckt.

Se även

Referenser

Vidare läsning

externa länkar

Bibliotekets resurser om
grönt fluorescerande protein